共載阿霉素與小干擾RNA的脂質介孔硅納米粒的制備表征及抗多藥耐藥腫瘤細胞研究 Δ

張夢瑋 ，楊碩曄 ，楊亞南 ，王振威 ，屈凌波 （1.河南工業大學生物工程學院，鄭州 450001；.鄭州市生物醫藥功能分子重點實驗室，鄭州 450001；.鄭州大學化學與分子工程學院，鄭州 450001）

對于乳腺癌等惡性腫瘤，以阿霉素（doxorubicin，DOX）為代表的化學藥治療仍是目前臨床上常用的治療手段，但隨著藥物的反復使用，多藥耐藥（multiple drug resistance，MDR）已成為化療失敗的一個重要誘因。MDR1基因過表達是引發 MDR 的主要原因，其編碼的P-糖蛋白（P-glycolprotein，P-gp）介導的藥物外排是經典的耐藥機制[1―2]。納米載體可通過高滲透長滯留效應積聚于腫瘤部位，且具有功能化程度高、生物相容性好等優點[3]。根據腫瘤微環境特性開發出的刺激響應型納米載藥系統，當其受到如微酸性、高水平谷胱甘肽（gluta‐thione，GSH）等微環境刺激時會迅速進入活化狀態，載體結構發生改變，可在抑制MDR型腫瘤P-gp表達的同時，實現化療藥物的持續控釋，從而協同增強對MDR型腫瘤的治療效果[4—5]。

腫瘤細胞內通常呈現微酸性，且GSH水平為正常組織細胞的3倍以上[6]，故可利用還原性差異設計出對高水平GSH敏感的還原響應型納米載體。氧化還原反應會促進納米載體的降解，有效降低材料對細胞的毒性，常見的還原敏感鍵主要有二硫鍵（－SS－）、二硒鍵等，其中－SS－和GSH會發生氧化還原反應，從而導致自身被還原為巰基，使載體降解而釋放化療藥物，進而實現在腫瘤組織部位的靶向控釋[7―8]。基于此，本文以介孔硅納米粒（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）為基礎制備MSNs-SS-NH2@DOX，并以陽離子脂質體（cationic liposomes，CLs）對其包覆制得 CLMSNs-SSNH2@DOX，進一步負載小干擾RNA（siRNA，可下調耐藥細胞中P-gp的表達，有效逆轉腫瘤MDR，提高抗腫瘤效果[9]）得到CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA復合載藥系統；再以耐DOX型乳腺癌細胞MCF-7/ADR為研究對象，考察該制劑抗MDR型腫瘤細胞的作用，以期為其開發及后續臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有JEM-2100F型透射電子顯微鏡（日本Hitachi公司），Nano ZS90s型納米粒度儀（英國Malvern公司），ASAP 2460型物理吸附儀（美國麥克公司），Nicolet IS10型傅里葉紅外光譜儀、Attune NxT型流式細胞儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），Axio observer3型熒光顯微鏡（德國Zeiss公司），DSC214型差示掃描量熱儀（德國耐馳公司），D8型X射線衍射儀（德國布魯克公司）。

1.2 主要藥品與試劑

DOX原料藥 （批號N1111A，含量＞98%）、DOX對照品 （批號 N1111AS，含量＞99%）購自大連美侖生物技術有限公司；十六烷基三甲基溴化銨、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、乙二酸酐、二乙醇胺、硅酸四乙酯、異硫氰酸熒光素（FITC）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二油酰基三甲胺丙烷甲基硫酸鹽（DOTAP）、二硬脂酰基磷脂酰膽堿（DSPC）、二棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG）均購自美國Avanti公司；Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術公司；兔源P-gp一抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G二抗購自美國LI-COR公司；siRNA由寧波康貝生化有限公司合成。

1.3 細胞

耐DOX型乳腺癌MCF-7/ADR細胞由河南工業大學生物工程學院細胞功能調控創新實驗室提供。

2 方法與結果

2.1 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的制備

采用模板劑法[10]制備MSNs。取100 mg MSNs置于10 mL無水乙醇中，超聲（功率50 W，頻率40 kHz，下同）20 min后加入2 mL APTES，并于60 ℃反應20 h，離心收集沉淀，真空干燥即得MSNs-NH2。向100 mg MSNs-NH2中加入10 mL丙酮，30 min后逐滴加入5 mL含有1.5 mol/L乙二酸酐的丙酮溶液，室溫下攪拌24 h，所得沉淀即為MSNs-COOH。向100 mg MSNs-COOH中加入20 mL磷酸鹽緩沖液（pH5.0）、75 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽、75 mg N-羥基琥珀酰亞胺，攪拌活化2 h后，向其中加入1 g半胱氨酸鹽酸鹽，在氮氣保護條件下于35 ℃攪拌24 h，離心收集沉淀即得MSNs-SS-NH2。取MSNs-SS-NH2與DOX適量（兩者質量比為2∶1），攪拌24 h后即得MSNs-SS-NH2@DOX。

取100 mg DOTAP、50 mg膽固醇、30 mg DPPG、30 mg DSPC、8 mL氯仿，超聲溶解后緩慢旋蒸成膜，即得CLs。取CLs與DOX適量（兩者質量比為2∶1）超聲融合5 min，即得CLs@DOX。將CLs分別與上述所得MSNs-SS-NH2、MSNs-SS-NH2@DOX溶液混合并超聲后，即得CLMSNs-SS-NH2、CLMSNs-SS-NH2@DOX。將干粉狀siRNA離心10 min后溶于375 μL DEPC水中，然后與CLMSNs-SS-NH2@DOX渦旋混勻，即得CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA（現用現配），并以50 nmol為siRNA的最佳負載量。

2.2 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的表征

2.2.1 粒徑及Zeta電位分析 將適量MSNs-SSNH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX 和CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA分散于去離子水中超聲均勻，測定其粒徑和Zeta電位。結果顯示，MSNs-SSNH2@DOX的粒徑為（153.73±15.6） nm，Zeta電位為（35.13±0.73） mV，多分散性指數（polydispersity index，PDI）良好。因CLs@DOX表面存在大量正電荷且粒徑[（168.77±3.84） nm]較MSNs-SS-NH2@DOX有所增大，故經CLs包埋后CLMSNs-SS-NH2@DOX的粒徑[（160.03±7.13） nm]增大且Zeta電位增大至（104.83±1.86） mV，這說明CLs可有效包覆于MSNs-SS-NH2表面。進一步負載siRNA后，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的粒徑[（197.63±3.75） nm]增大，且由于核酸呈負電性，故使其Zeta電位略有降低，這提示CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA可與靜息狀態下呈負電性的細胞相互吸引，以提高細胞攝取效率。

2.2.2 微觀形態分析 分別取MSNs-SS-NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX和CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA適量分散于95%乙醇中，然后分別滴于銅網上，經充分干燥后，采用透射電子顯微鏡進行觀察。結果顯示，MSNs-SS-NH2@DOX的介孔結構清晰，粒徑均一，分散性較好；其經CLs包覆后，所得CLMSNs-SSNH2@DOX表面出現一層透明脂膜；進一步負載siRNA后，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA結構清晰，表面脂膜層明顯，這說明該納米載體構建成功。結果見圖1。

圖1 不同修飾型納米載體的透射電子顯微圖

2.2.3 差示掃描量熱分析 分別取MSNs-SS-NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA適量置于差示掃描量熱儀中，設置升溫速率為7 ℃/min，在N2保護條件下檢測各樣品在－50～300 ℃范圍內的吸放熱峰形。結果顯示，MSNs-SS-NH2@DOX在60 ℃處有一明顯吸熱峰，表明其在該溫度下可由不定形狀態轉變為結晶態。CLs@DOX在90 ℃處有一明顯吸熱峰，表明其可由固態轉變為凝膠態。MSNs-SS-NH2@DOX經CLs包埋后相變溫度約為75 ℃，相較于原始相變溫度有所提高，表明以CLs包埋可提高MSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的熱穩定性。結果見圖2A。

2.2.4 X射線衍射分析 分別取MSNs-SS-NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的干燥粉末適量，置于X射線衍射光譜儀中檢測。結果顯示，MSNs-SS-NH2@DOX在22°處有一個特征吸收峰，CLs@DOX在32°處有一個特征吸收峰，CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA在22°和32°處均有特征吸收峰，這表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA已成功構建。結果見圖2B。

圖2 不同修飾型納米載體的差示掃描量熱圖、X射線衍射圖、傅里葉紅外光譜圖及物理吸附-脫附曲線

2.2.5 紅外光譜分析 分別取MSNs-SS-NH2@DOX、CLs@DOX、CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的干燥粉末適量與溴化鉀粉末混合，充分研磨均勻后，置于傅里葉紅外光譜儀上檢測。結果顯示，MSNs-SS-NH2@DOX在1 680 cm－1處出現－SS－特征吸收峰，這表明－SS－成功連接至MSNs表面。CLs在2 930 、2 850 cm－1處均出現長鏈脂肪酸C－H伸縮振動峰。經CLs包埋后，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA在1 240 cm－1處的P＝O伸縮振動峰變寬，且位于3 500 cm－1處的硅醇基團的伸縮峰有所減弱，這表明CLs可包覆于MSNs-SSNH2@DOX表面。結果見圖2C。

2.2.6 物理吸附分析 分別取MSNs-SS-NH2、CLMSNs-SS-NH2的干燥粉末適量，于氮氣環境中置于物理吸附儀上進行檢測。結果顯示，MSNs-SS-NH2的物理吸附-脫附曲線下面積最大。經CLs包覆后，CLMSNs-SS-NH2的物理吸附-脫附曲線下面積減小，這表明CLs已成功包裹于MSNs-SS-NH2表面。結果見圖2D。

2.3 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的體外釋放度測定

采用高效液相色譜法[11]測定CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA在不同pH條件下（pH5.0、pH7.4）及不同GSH濃度下（0、2、5、10 mmol/L）DOX的體外釋放度。結果顯示，在同一pH條件下，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA中DOX的釋放度與GSH的濃度成正比，且在pH5.0條件下DOX的釋放度均高于pH7.4條件下，這表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA具有良好的pH/還原雙重響應釋藥特性。結果見圖3。

圖3 不同pH條件下CLMSNs-SS-NH2@DOX中DOX的體外釋放度

2.4 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的細胞實驗考察

2.4.1 細胞攝取的考察 將對數生長期的MCF-7/ADR細胞以1×104個/孔接種于12孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后，棄去培養基，然后分為DOX組、MSNs-SS-NH2@DOX組、CLs@DOX組、CLMSNs-SSNH2@DOX組和CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組，各組DOX的含量均為5 μg/mL（濃度根據前期預實驗結果設置）。每組設3個復孔。各組加入相應含藥培養基避光孵育12 h，以10 μg/mL Hochest33342染色30 min，再以磷酸鹽緩沖液洗滌2～3次后，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞的攝取情況，并采用Image J 1.48v軟件對DOX的熒光強度進行定量分析。采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析，數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α＝0.05。結果顯示，與DOX組（熒光強度為0）比較，其余各組細胞熒光強度（分別為27.7±1.7、31.2±1.8、159.7±10.3、193.7±7.6）均顯著增強（P＜0.05），且 CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組細胞熒光強度最強，這提示CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA的介導入胞能力最強。結果見圖4。

圖4 各組MCF-7/ADR細胞攝取情況的熒光顯微圖

2.4.2 細胞遷移的考察 將MCF-7/ADR細胞以5×103個/孔接種于24孔板中，分為對照組、DOX組、MSNs-SSNH2@DOX組、CLs@DOX組、CLMSNs- SS-NH2@DOX組、CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組，各組DOX的含量均為5 μg/mL。每組設3個復孔。各組加入相應含藥培養基后，用200 μL移液管尖劃過各孔孔底形成垂直傷口，采用顯微鏡觀察培養0 h和 24 h時的細胞遷移情況。結果顯示，培養24 h后，對照組劃痕明顯變窄，MCF-7/ADR細胞的遷移率為（35.0±0.56）%，表明MCF-7/ADR細胞具有較強的遷移能力，其余各組MCF-7/ADR細胞的遷移率[分別為（20.0±0.45）%、（21.30±0.72）%、（18.00±0.23）%、（15.80±0.42）%、（8.00±0.34）%]較對照組均顯著降低（P＜0.05），且CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組細胞遷移率最低，表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA可顯著抑制MCF-7/ADR細胞遷移。結果見圖5。

2.4.3 細胞凋亡的考察 將MCF-7/ADR細胞以2×104個/孔接種于6孔板，按“2.4.2”項下方法分組與給藥，每組設3個復孔。繼續培養24 h后收集細胞沉淀，加入500 μL 結合液重懸均勻，分別加入 5 μL Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶（PI）染色液，室溫孵育10 min后，采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。結果顯示，培養24 h后，對照組MCF-7/ADR細胞的總凋亡比例為（10.19±0.56）%，其余各組MCF-7/ADR細胞的總凋亡比例[分別為（18.84±0.25）%、（18.84±0.45）%、（24.86±0.75）%、（30.55±1.08）%、（40.90±0.78）%]較對照組均顯著升高（P＜0.05），且CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組細胞總凋亡比例最高，表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA可促進MCF-7/ADR細胞凋亡。結果見圖6。

圖6 各組MCF-7/ADR細胞的凋亡流式細胞圖

2.4.4 細胞周期的考察 將MCF-7/ADR細胞以2×104個/孔接種于6孔板中，按“2.4.2”項下方法分組與給藥，每組設3個復孔。繼續培養24 h后收集細胞沉淀，以磷酸鹽緩沖液洗滌1～2次后，于4 ℃條件下以1 mL 75%乙醇固定過夜；離心棄上清液，以磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入500 μL PI染色液，于37 ℃避光培養30 min后，采用流式細胞儀檢測各組細胞周期。結果顯示，培養24 h后，對照組MCF-7/ADR細胞G0/G1期所占比例為（21.00±0.65）%，其余各組MCF-7/ADR細胞G0/G1期所占 比 例[分別 為（35.40±1.12）%、（37.85±0.95）%、（42.33±1.37）%、（45.50±0.57）%、（63.90±2.37）%]較對 照 組 均 顯 著 升 高（P＜0.05），且 CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA組細胞G0/G1期所占比例最高，表明CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA可將MCF-7/ADR細胞的生長周期明顯阻滯于G0/G1期，以增強逆轉腫瘤細胞MDR的效果。

2.4.5 細胞中P-gp表達的考察 將MCF-7/ADR細胞以2×104個/孔接種于6孔板中，按“2.4.2”項下方法分組與給藥，每組設3個復孔。繼續培養24 h后收集細胞沉淀，置于冰上裂解15 min，提取總蛋白。蛋白經變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，室溫封閉，加入P-gp抗體（稀釋度為1∶1 000），4 ℃孵育18 h；常溫閉光孵育二抗（稀釋度為1∶15 000）1 h，洗膜；采用雙色紅外激光成像系統顯色，以GAPDH作為內參，采用Image J 1.48v軟件分析目的蛋白灰度值，以目的蛋白條帶與內參蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。結果顯示，與對照組（灰度值比值為1）和DOX組（灰度值比值為0.93±0.08）比較，其余各組MCF-7/ADR細胞中P-gp表達水平（灰度值分別為0.82±0.03、0.75±0.05、0.45±0.03、0.39±0.02）均顯著降低（P＜0.05），且CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA組MCF-7/ADR細胞中P-gp表達水平最低，表明該制劑遞送的外源siRNA可被有效內化，從而下調P-gp的表達，逆轉MCF-7/ADR細胞MDR。結果見圖7。

圖7 各組 MCF-7/ADR細胞中P-gp蛋白表達的電泳圖

3 討論

MSNs-SS-NH2具有中空介孔結構及較大的比表面積，以CLs對其包覆后，制得的CLMSNs-SS-NH2復合載體具有更好的生物相容性，可提高藥物裝載量，并使藥物積聚于腫瘤部位釋放。另外，由于CLs帶正電荷可有效將呈弱負電性的siRNA以靜電吸附方式荷載[12―13]，從而制得同時負載DOX和siRNA的CLMSNs-SSNH2@DOX/siRNA，該制劑理化性質良好，且具有良好的pH/還原雙重響應釋藥特性。這可能是由于在酸性環境中該制劑脂膜層更容易被破壞，進一步在腫瘤微環境中促使－SS－斷裂，進而使DOX在腫瘤細胞內積聚釋放[14―16]。細胞實驗結果顯示，CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA可將DOX和siRNA有效遞送至MCF-7/ADR細胞內，進而抑制細胞遷移增殖，促進細胞凋亡，阻滯細胞于G0/G1期，并下調P-gp的表達以逆轉腫瘤細胞MDR。

綜上所述，本研究成功制備同時負載DOX和siRNA的CLMSNs-SS-NH2@DOX/siRNA；該制劑理化性質良好，具有pH/還原雙重響應釋藥特性，且可通過下調P-gp表達逆轉MCF-7/ADR細胞MDR。