京紅桃及其晚熟芽變晚京紅果實差異表達轉錄因子的轉錄組分析

王海靜， 李曉潁， 殷亞蕊， 宋立琴， 張立彬， 武軍凱

(河北科技師范學院園藝科技學院/河北省特色園藝種質挖掘與創新利用重點實驗室，河北秦皇島 066004)

桃(Prunuspersica)是重要的核果類果樹之一，對于其果實成熟期的研究也備受關注。果實的成熟是一個涉及多層次、多個代謝通路的復雜過程，是大量基因協同表達和調控的結果[1]。而轉錄因子作為調控因子在基因表達調控過程中發揮著重要作用，它們與靶基因上游的特定DNA元件相結合，激活或抑制靶基因的轉錄活性，從而調控靶基因的時空特異性表達[2-3]。多種轉錄因子(transcription factors，TFs)共同參與調控了果實成熟的復雜過程，包括參與植物激素合成及信號轉導途徑的AP2/ERF和EIN3/EILs，以及NAC、MYC、MYB、WRKY、bHLH、HSF、MADS-box、bZIP等轉錄因子家族成員[4-12]。在桃果實發育過程中，許多轉錄因子編碼基因也以特定的方式調控相應靶基因的表達。比如，bZIP家族的一個轉錄因子基因在桃果實成熟初期有特異性高表達，在番茄中過表達該基因表現為果實成熟階段的延長，表明該bZIP轉錄因子參與了桃果實的成熟進程[4]。而HD-ZIP homeobox基因(PpHB.G7)可以通過與乙烯生物合成基因PpACS1和PpACO1的啟動子區域互作而影響桃果實成熟過程[5]。NAC轉錄因子對果實成熟同樣至關重要，其主要通過結合啟動子NACRS(NAC recognition sequence)或NACBS(NAC binding sequence)等元件，以實現對靶基因的轉錄調控進而影響多種果樹果實的成熟過程。如果NAC基因外顯子中有堿基片段插入則可能導致桃果實早熟[6-8]。MADS-box轉錄因子家族成員也參與了桃果實的成熟、軟化和衰老進程[9-10]。乙烯轉錄因子(ethylene response factor，ERF)參與調控果樹果實成熟過程也是近期研究熱點之一。PpeERF2通過與啟動子結合進而抑制2個脫落酸(ABA)生物合成基因(PpeNCED2和PpeNCED3)和一個細胞壁降解基因(PpePG1)的表達以調控桃果實成熟[11]。而與番茄成熟相關ERF同源的桃PpERF.E2基因在整個果實發育過程中高表達，該因子能夠激活PpACS1和PpACO1，進而調控乙烯的生物合成。不同的ERFs可作為轉錄激活子或者轉錄抑制子與靶基因啟動子作用，通過反饋調控乙烯合成相關基因的表達來影響乙烯生成，進而參與調控果實成熟[12]。

筆者所在課題組在前期研究中發現了京紅的晚熟芽變晚京紅，成熟期比京紅晚19 d。本試驗以京紅(W)和晚京紅(M)為材料研究桃果實成熟期調控的分子機制，通過分析2種果實發育及成熟階段的差異表達轉錄因子及其表達模式，挖掘桃果實成熟過程中發揮重要作用的轉錄因子家族。該試驗結果有助于提高對參與桃果實成熟調控的轉錄因子家族的認識，有利于更深入地理解桃果實成熟調控網絡以及不同代謝通路之間的互作關系，以期為通過分子手段調控桃果實成熟期奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源

供試桃品種京紅及其晚熟芽變晚京紅采自河北科技師范學院試驗基地。在京紅盛花(days after full bloom，簡稱DAB)后40、60、70 d及其晚熟芽變晚京紅盛花后60、70、80 d取果實進行轉錄組測序，對應樣本名稱分別為W1、W2、W3以及M1、M2、M3。隨機采收每個階段果實，各重復3次，取樣后分別將果皮與果肉切碎混勻，-80 ℃保存備用。

1.2 差異表達轉錄因子基因分析

基因表達量的計算采用FPKM(fragments per kilobase per millionreads)方法。樣本間差異表達基因的篩選及分析使用DESeq2軟件，篩選閾值為 |log2(fold chang，FC)|≥1并且校正P<0.05。同時，與桃基因組數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)進行BLAST比對，并結合PlantTFDB數據庫(plant transcription factor database 3.0，http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)以篩選差異表達轉錄因子基因。設計以下6個比對方案W1 vs W2、W1 vs W3、W2 vs W3和M1 vs M2、M1 vs M3、M2 vs M3分別分析京紅和晚京紅在各自的發育及成熟過程中轉錄因子的表達情況，以及2個桃栽培種盛花后 60 d 比較組(W2 vs M1，60 DAB)和盛花后70 d比較組(W3 vs M2，70 DAB)用于分析京紅和晚京紅在相同的花后時間差異表達轉錄因子。

根據京紅和晚京紅果實轉錄組數據中各轉錄因子基因的FPKM值，分析差異表達轉錄因子的表達模式。log2(FC)值進行均一化后，對一些差異表達轉錄因子進行表達模式聚類分析。

1.3 實時熒光定量PCR驗證

從RNA-seq數據中選取與果實成熟相關的9個具有不同表達模式的基因和轉錄因子，通過熒光定量PCR(qRT-PCR)進行驗證。依據候選基因ID從數據庫中檢索得到對應的cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件進行特異性引物設計，以TEF2為內參基因，引物序列見表1，由中美泰和生物技術(北京)有限公司合成。反應在伯樂CF Connect實時熒光定量PCR儀上運行，程序為95 ℃預變性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，45個循環。相對表達水平用2-ΔΔCT法[13]計算。每個樣品各3次獨立的生物學重復。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 京紅及晚京紅果實轉錄因子統計分析

從轉錄組測序數據中共鑒定出41個轉錄因子家族的302個轉錄因子基因，轉錄因子家族中基因數目較多的有B3家族(34個)、MYB-related(31個)、NAC家族(24個)、HB-other家族(19個)、C3H家族(18個)、FAR1家族(17個)、MYB家族(16個)、bHLH家族(15個)、bZIP家族(15個)和M-type MADS家族(13個)，分別占鑒定轉錄因子基因總數的11.26%、10.26%、7.95%、6.29%、5.96%、5.63%、5.30%、4.97%、4.97%和4.30%。其中，差異表達的轉錄因子基因有158個，占鑒定總數的52.3%，分屬于33個轉錄因子家族，包括B3(17個)、NAC(17個)、MYB-related(15個)、HB-other(14個)、bHLH(12個)、MYB(11個)、WRKY(10個)、bZIP(7個)和C3H(7個)等(圖1)。

2.2 京紅和晚京紅發育及成熟過程中差異表達轉錄因子分析

在京紅發育成熟過程中，W1 vs W2比較組中差異表達的轉錄因子基因62個(21個TFs家族)，上調表達17個，下調表達45個，基因數量較多的轉錄因子家族有B3、MYB-related、NAC、WRKY、bHLH和MYB。W1 vs W3比較組中，差異表達的轉錄因子基因84個(24個TFs家族)，上調表達32個，下調表達52個，基因數量較多的轉錄因子家族有NAC、B3、MYB-related、bHLH、WRKY和MYB。在W2 vs W3比較組中，差異表達的轉錄因子基因51個(23個TFs家族)，其中上調表達26個，下調表達25個，基因數量較多的轉錄因子家族有HB-other、MYB-related、MYB。對京紅發育及成熟過程中3個階段比較組的差異表達轉錄因子進行綜合分析顯示，大量差異表達轉錄因子集中在B3、MYB-related、NAC、WRKY、bHLH、MYB家族(表2)。在晚京紅發育成熟過程中，M1 vs M2比較組中差異表達的轉錄因子基因60個(17個TFs家族)，其中上調表達25個，下調表達35個，在M1 vs M3比較組中，差異表達的轉錄因子基因108個(26個TFs家族)，上調表達47個，下調表達61個，在M2 vs M3比較組中，差異表達的轉錄因子基因78個(21個TFs家族)，上調表達30個，下調表達48個，對這3個發育及成熟階段的差異表達轉錄因子進行綜合分析發現，NAC、MYB-related、bHLH、HB-other、B3、MYB等家族的轉錄因子較多參與到了晚京紅發育及成熟的過程中(表2)。

在京紅W1 vs W2、W1 vs W3以及W2 vs W3比較組各有10、17、5個特異表達轉錄因子。而在晚京紅中，M1 vs M2、M1 vs M3以及M2 vs M3比較組分別有6、23、9個特異表達轉錄因子，晚京紅M1 vs M3和M2 vs M3重疊部分包含60個轉錄因子，遠高于京紅中相應的數量。分析2個栽培種各自發育成熟階段比較組的時期特異性表達轉錄因子，發現參與京紅發育及成熟過程的WRKY家族基因數量高過晚京紅中的數量。晚京紅發育及成熟過程中 HB-other家族轉錄因子數量較京紅多(圖2，表2)。

2.3 京紅和晚京紅60 DAB和70 DAB比較組共有和特異表達轉錄因子分析

為研究導致京紅和晚京紅果實發育成熟期差異的影響因素，對二者果實在60 DAB和70 DAB的差異表達轉錄因子進行分析，結果(表3)表明，60 DAB比較組中，京紅和晚京紅差異表達的轉錄因子基因35個(18個TFs家族)， 27個基因上調表達，8個基因下調表達，主要包括了MYB、B3、bHLH、M-type MADS及MYB-related等轉錄因子家族基因，差異最大的轉錄因子是MYB6(LOC18770134)，下調最顯著的是MYB-related家族RAX2基因(LOC18772781)(表3)。70 DAB比較組中，差異表達的轉錄因子基因33個(20個TFs家族)，包括25個上調和8個下調，分屬于HB-other、B3、MYB及MYB-related等轉錄因子家族。上調最顯著的是一個未知轉錄因子基因(LOC18781353)，下調最顯著的轉錄因子是ERF家族EAF-1(LOC18772983)。在京紅和晚京紅60 DAB和70 DAB比較組有15個共同差異表達轉錄因子。轉錄因子呈現出不同的調節模式，既表現為同一轉錄因子在2個比較組中均上調表達，或在一個比較組上調表達而在另一個比較組下調表達，也表現為同一轉錄因子家族不同成員在同一比較組內或不同比較組間呈現出不同的上調或下調表達(表3、圖3)。

表2 差異表達轉錄因子基因家族基本信息 個

表3 京紅和晚京紅60 DAB和70 DAB比較組差異表達轉錄因子基本信息

表3(續)

在京紅和晚京紅果實發育成熟60 DAB比較組中，20個特異表達轉錄因子基因中有15個上調表達，分屬于M-type MADS、DBB、B3、GRAS、SBP、MYB、WRKY、MYB-related、M-type、HB-other、bHLH、AP2和ERF家族，5個下調表達轉錄因子家族包括NAC、MYB、E2F/DP和B3家族。MYB6(LOC18770134)上調表達差異最顯著，E2F/DP家族E2FC轉錄因子(LOC18788614)下調表達差異最顯著。而在京紅和晚京紅果實發育成熟70 DAB比較組中，18個特異表達轉錄因子基因中有5個下調表達，包括ERF、B3和HB-other家族成員，13個上調表達基因分屬于ZF-HD、YABBY、C3H、SBP、HB-other、HSF、GATA、SBP、Dof、MYB-related和NAC家族。MYB-related家族LHY(LOC18785550)和ERF家族EAF-1(LOC18772983)分別為上調和下調表達差異最顯著基因(表3)。

2.4 差異表達轉錄因子聚類分析

為分析京紅和晚京紅差異表達轉錄因子基因在整個發育成熟階段的表達模式，對60 DAB、70 DAB比較組差異表達轉錄因子基因進行了聚類分析。表達模式主要分為2種類型，第1種類型轉錄因子基因表達水平隨發育進程下調表達，而其中的LOC18777555(MYB7)，LOC18782264(PIF4)，LOC18770134(MYB6)，LOC18776591(TCP5)，LOC18777454(YABBY 4)，LOC18768867(ARF2)和LOC18766660(WRKY69)等在京紅果實發育成熟過程的W1期有較高水平表達，而在晚京紅整個發育成熟階段表達量均不高(圖4)。第2種類型轉錄因子基因表達水平隨發育進程上調表達，其中的LOC18779876(NAC73)，LOC18791957(MYB-related EFM)，LOC18769821(ATHB-40)，LOC18772781(MYB-related RAX2)，LOC19770626(NAC3)，LOC18766489(未知轉錄因子)，LOC18767504(HSF)以及LOC18773097(CPRF2)在京紅果實發育成熟整個階段和晚京紅發育M1、M2期表達量均不高，而在晚京紅果實M3期有較高水平表達。此外，LOC18793312(HOX3)和LOC18772983(EAF-1)在京紅果實W3期有較高水平表達，而在晚京紅果實發育成熟整個階段和京紅發育M1、M2期表達量均不高(圖4)。

2.5 qRT-PCR驗證

為了進一步驗證轉錄組測序結果的準確性，從RNA-seq測序數據中隨機挑取差異表達的9個基因，通過qRT-PCR對其基因表達量進行檢驗，如圖5所示，9個基因的相對表達水平與RNA-seq分析結果一致，表明了轉錄組數據的可靠性。

3 結論與討論

桃果實成熟是一個復雜而有序的生理生化過程，涉及色澤、風味、香氣、質地等品質指標的變化，直接影響果品的商品價值、上市時間、貨架期和市場競爭力，因此，桃果實成熟機制研究對于桃產業發展有重要的意義。基于此，本研究以京紅及其晚熟芽變晚京紅為試驗材料，對二者各自發育成熟過程以及二者之間的差異表達轉錄因子進行分析，共鑒定得到41個轉錄因子家族的158個差異表達轉錄因子，分屬于B3、MYB-related、NAC、HB-other、C3H、FAR1、MYB、bHLH、bZIP和M-type MADS等轉錄因子家族。

轉錄因子在同一種質不同發育成熟階段其轉錄表達水平具有時期特異性。通過比較2個栽培種在不同發育成熟階段的差異表達轉錄因子，發現均有其特異性和共同性表達轉錄因子(圖2、表2)，表明這些轉錄因子以不同的轉錄調控方式參與了階段性生理過程和生化代謝途徑。不論是京紅還是晚京紅均有大量轉錄因子家族及轉錄因子隨發育成熟進程的推進而表達，有些轉錄因子基因表達量變化幅度較大，并且轉錄因子在各成熟發育階段的轉錄表達水平及表達模式具有種質特異性(表3、圖4)，這表明不同類型的轉錄因子發揮特定分子功能調控了果實發育成熟過程中不同的生物過程，也可以解釋2個栽培種果實成熟期的差異性，這種差異性可能是晚京紅通過轉錄因子的差異性表達促進或抑制某些生理代謝途徑相關基因的表達，重新組織和調節了生理生化代謝活動，導致了成熟期的延長[5，8]。

表達模式分析顯示，多個轉錄因子在晚京紅發育過程中有顯著的變化或在某階段有較高水平的表達，而在京紅果實發育的各個階段表達水平不高、表達水平沒有變化或者與晚京紅表現出相反的表達趨勢。綜合分析表達量和表達模式發現，NAC家族(NAC73，LOC18779876；NAC3，LOC19770626)、MYB-related家族(EFM，LOC18791957； RAX2，LOC18772781)、HB-other家族(ATHB-40，LOC18769821)、HSF(LOC18767504)以及bZIP家族(CPRF2，LOC18773097)轉錄因子在晚京紅果實成熟啟動前后變化明顯，證實了這些家族的轉錄因子參與了芽變晚京紅果實成熟的調控過程[14-17]，對果實的晚熟機制起到了重要的作用。MYB家族(MYB7，LOC18777555；MYB6，LOC18770134)、bHLH家族(PIF4，LOC18782264)、TCP家族(TCP5，LOC18776591)、YABBY家族(YABBY 4，LOC18777454)、ARF家族(ARF 2，LOC18768867)和WRKY家族(WRKY69，LOC18766660)相應轉錄因子在京紅果實發育成熟過程的W1期有較高水平表達，而HB-other家族(HOX3，LOC18793312)和ERF家族(EAF-1，LOC18772983)僅在京紅果實W3期有較高水平表達(圖4)，與晚京紅中相應表達模式存在較大差異，同樣可作為成熟期延長研究的候選基因[8，11，18]。

本研究發現晚京紅發育成熟過程中HB-other家族轉錄因子數量較京紅多。HB-other家族轉錄因子在發育成熟過程中呈現不同的表達模式[18]，如LOC18769821和LOC18793312。ERF轉錄因子為PETALA2 (AP2)/ERF基因超家族成員，其特征是保守的60～70個氨基酸殘基組成的AP2/ERF DNA結合結構域[19-20]。ERF轉錄因子通過核心AGCCGCC序列直接結合到GCC-box，或者結合到下游基因的DRE基序，反饋調控乙烯合成相關基因的表達來影響乙烯生成，進而參與調控果實成熟[11-12，21]。在桃基因組中推定的ERF轉錄因子有116個[22]，已有研究對桃ERF的表達譜進行了報道[23-25]。Zhou等也對成熟期油桃ERF轉錄因子表達進行分析，發現了12個ERF轉錄因子表達量較高[12]，但不含本研究關注的ERF(LOC18772983)。ERF(LOC18772983)基因在京紅果實中表達量隨果實發育成熟呈升高趨勢，果實成熟前的表達量顯著上調至最高，表達量在60 DAB較40 DAB增幅較小(1.54倍)，而在70 DAB表達量增幅達到13.3倍。在晚京紅果實中，該基因表達量呈逐漸降低趨勢，果實成熟前的表達量顯著下調，70 DAB表達量與60 DAB相當(-1.03倍)，80 DAB表達量較70 DAB降低幅度較大(-6.25倍)。

由一些轉錄因子基因在2個栽培種中相反的表達模式可推斷其在京紅和晚京紅中可能分別作為轉錄激活子和轉錄抑制子調控乙烯合成基因的表達，進而影響了京紅和晚京紅果實成熟過程[12]，這也進一步說明了轉錄因子參與桃成熟調控網絡的復雜性。由以上分析可知，眾多轉錄因子家族成員均參與到了桃成熟期相關的調控過程，而在果樹中轉錄因子調控果實發育成熟是一個極其復雜的動態網絡[26-27]，這些轉錄因子如何互作調控尚待進一步深入研究。

本研究基于京紅及其晚熟芽變晚京紅果實發育成熟過程的轉錄組數據，鑒定出158個差異表達轉錄因子，主要包括了B3、MYB-related、NAC、WRKY、bHLH、MYB和HB-other等轉錄因子家族基因。對2個栽培種在相同花后時間的差異表達轉錄因子進行了表達量和表達模式分析，發現NAC家族(NAC73，LOC18779876；NAC3，LOC19770626)、MYB-related家族(EFM，LOC18791957；RAX2，LOC18772781)、HB-other家族(ATHB-40，LOC18769821；HOX3，LOC18793312)，HSF(LOC18767504)、bZIP家族(CPRF2，LOC18773097)、MYB家族(MYB7，LOC18777555；MYB6，LOC18770134)、bHLH家族(PIF4，LOC18782264)、TCP家族(TCP5，LOC18776591)、YABBY家族(YABBY 4，LOC18777454)、ARF家族(ARF 2，LOC18768867)、WRKY家族(WRKY69，LOC18766660)以及ERF家族(EAF-1，LOC18772983)轉錄因子基因在晚京紅成熟期延長的調控過程中發揮了作用。本研究結果可為桃特定轉錄因子家族基因在果實成熟過程中的功能研究提供參考。