基于三色堇全長轉錄組的MYB基因家族鑒定

谷 佳， 王童欣， 饒 英， 潘慶龍， 李霆格， 趙 瑩， 周 揚， 彭 婷， 王 健

(1.熱帶特色林木花卉遺傳與種質創新教育部重點實驗室/海南省熱帶特色花木資源生物學重點實驗室/海南大學林學院，海南海口 570228；2.貴州大學農學院，貴州貴陽 550025)

植物在生長發育過程中受到多種轉錄因子調控，如WRKY、MYB、AP2/ERF轉錄因子等[1]，其中MYB家族具有特定的保守結構域，根據其結構域重復的次數可分為4R-MYB、3R-MYB、1R-MYB、R2R3-MYB 等4類，其中R2R3-MYB 轉錄因子是MYB家族中最重要的、目前研究最廣泛的一類轉錄因子，在植物體內廣泛存在[2]。MYB轉錄因子對植物具有重要影響，可以參與植物根、莖、葉和花的生長[3]，也可調控植物代謝，如調節類黃酮、花青素等物質合成[4]。目前，通過基因組以及轉錄組數據對物種進行MYB基因家族進行鑒定，從而對物種生長發育進一步進行研究探索，已經在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、彩葉楊(Populusdeltoids)、甘蔗(Saccharumsp.)等物種進行MYB基因家族研究，如擬南芥中發現含有126個R2R3-MYB、64個1R-MYB、5個3R-MYB、1個4R-MYB[2]，在彩葉楊中已被鑒定出183 個R2R3-MYB、 5個3R-MYB、1個4R-MYB和 113個1R-MYB[5]，在甘蔗中鑒定出57個R2R3-MYB、13個1R-MYB[6]，進行基因家族的鑒定已經成為MYB功能挖掘的重要研究手段。

三色堇(Viola×wittrikiananGams.)為堇菜科堇菜屬植物，是常見的花卉植物，因其花斑形狀多樣，顏色多彩而具有較高的觀賞價值和經濟價值，國內外應用十分廣泛。目前，對三色堇MYB基因家族分析未見報道，其在三色堇中基因功能尚不清楚。本研究通過對三色堇3代全長轉錄組測序，在三色堇3代全長轉錄組數據的基礎上鑒定出三色堇MYB轉錄因子并對其序列特征、蛋白質保守基序、進化關系等進行分析，對挖掘三色堇中具有特殊功能的MYB基因具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與序列來源

材料使用花瓣為黃底紫斑的三色堇(Viola×wittrockianaGams.)夢蝶，2020年1月種植于海南大學林學院基地，播種3個月后采摘三色堇植株的根、莖、葉、花并均勻混合，置于液氮中速凍，送廣州基迪奧生物科技有限公司利用單分子實時測序技術(SMRT)進行三色堇3代全長轉錄組測序。蛋白序列源于本測序上傳的所有轉錄組數據庫，擬南芥MYB家族氨基酸序列下載于Plant TFDB 3.0。

1.2 三色堇MYB轉錄因子鑒定與序列特征分析

從Pfam 31.0數據庫下載MYB結構域種子文件(PF00249)，之后利用HMMER 3.2.1 軟件創立Profile HMM(數值表格型隱馬可夫模型)[7]，檢索三色堇轉錄數據，對檢索結果去冗余，得到候選VwMYB蛋白序列。候選蛋白序列用SMART軟件預測[8]，再通過NCBI的Blastp分析，去除重復序列，得到三色堇MYB序列蛋白。利用在線工具 ExPAS軟件對三色堇 MYB轉錄因子家族成員的蛋白分子量(pW)、蛋白長度以及等電點(pI)等基本屬性進行分析[9]；利用CELLO v.2.5軟件進行亞細胞定位預測[10]。

1.3 三色堇MYB家族保守結構域分析

使用軟件MEGA-X中的ClustalW 對三色堇R2R3-MYB進行多序列比對，再利用 WebLogo軟件獲取序列標識。利用在線網站MEME和TBtools軟件分析三色堇MYB轉錄因子蛋白保守基序序列[11]。

1.4 三色堇R2R3-MYB轉錄因子系統發育分析

使用 MEGA-X軟件，利用鄰域連接(NJ)法，設置bootstrap(n=1 000)進行系統發育分析[12]。

2 結果與分析

2.1 三色堇MYB轉錄因子基因鑒定與分類

以MYB結構域序列作為靶序列，利用三色堇全長轉錄組數據進行篩選，得到141個MYB 轉錄因子，后通過SMART與Blastp 2次篩選最終得到121個MYB，分別編號VwMYB1～VwMYB121，其中共包含61個1R-MYB、57個R2R3-MYB以及3個 3R-MYB 類轉錄因子。

2.2 三色堇MYB類轉錄因子基本信息分析

對三色堇MYB轉錄因子家族成員的氨基酸序列、分子量、等電點進行分析，結果表明，三色堇MYB基因家族中，序列最長的為VwMYB61(Isoform0000184)，有1 996個氨基酸殘基，最短的為VwMYB91(Isoform0026081)，有119個氨基酸殘基；等電點從10.16 (VwMYB43，Isoform0045501)到4.44 (VwMYB75，Isoform0008562)；分子量從13.9 ku(VwMYB91，Isoform0026081)到216.3 ku (VwMYB61，Isoform0000184)。蛋白亞細胞定位預測顯示，多數MYB定位到細胞核，還有部分定位到細胞質、線粒體等(表1)。

表1 三色堇MYB轉錄因子基本信息

表1(續)

表1(續)

表1(續)

2.3 三色堇MYB保守基序分析

對121個三色堇MYB轉錄因子進行保守基序分析，獲得 20種保守motif元件(圖1)，其中分布頻次最高的是motif2(15.2%)，其次是motif4 (12.6%)，最低的是motif20 (0.3%)(圖2)。不同MYB蛋白的motif數量與分布存在差異，多數motif 元件分布在 N 端，少數(如 motif9)分布在MYB的C端，同一個亞組的基因具有相似基序，根據親緣性說明其具有相似功能，同時序列所含motif數量、類型與分布存在不同，表明不同基因功能之間具有差異，也存在一些高頻率基序，如motif 2幾乎存在于每一個亞組中，反映這個基序對VwMYB蛋白功能具有重要性。

R2和R3的保守結構域是識別MYB序列所必需的，通過WebLogo對三色堇的57個R2R3MYB序列位點信息進行分析，從圖3中可看出，三色堇R2R3-MYB類轉錄因子結構域存在R2R3MYB特有的W型保守氨基酸，R2 MYB與R3 MYB的結構域均含有52個氨基酸殘基，R2 MYB包含3個高度保守的色氨酸殘基(W)(圖3-A)，R3 MYB第1個色氨酸(第925位)被亮氨酸(L)所取代(圖3-B)，只有2個色氨酸殘基(W)。三色堇保守結構域特點與已報道擬南芥、辣椒、梨等物種一致[13]。

2.4 三色堇R2R3型MYB家族進化分析

將三色堇R2R3-MYB和擬南芥MYB蛋白家族進行系統發育分析，根據樊錦濤等對擬南芥R2R3-MYB族群的劃分依據，對三色堇R2R3-MYB類轉錄因子劃分亞群，結果見圖4[14]。三色堇R2R3-MYB類轉錄因子可劃分為30個亞群(A1～A30)，有8個亞群不能與擬南芥聚類，其他22個亞群可以聚類到擬南芥S1、S4、S6、S7、S9、S16、S18、S22、S23亞群中。聚類在同一個亞群的基因具有較高的同源性與序列相似性，并可能具有類似的功能[15]。

3 討論與結論

三色堇沒有參考基因組，這限制了對三色堇的深入研究，但利用3代測序技術可以快速得到全長轉錄組，獲得植物大部分有效的基因表達信息，是對非模式植物研究的新方法。本研究利用3代測序得到三色堇全長轉錄本，分析得到121個MYB轉錄因子，接近已報道玉米基因組分析發現的132個ZmMYB基因[16]，明顯高于亞洲百合基于2代轉錄組測序結果發現的69個LaMYB基因[17]，表明3代測序獲得高質量的cDNA全長序列與基因信息，為三色堇MYB轉錄因子研究提供有效參考。

MYB轉錄因子N端包含保守DNA 結合域，該結合域由1～4個不完全重復序列(R)構成，每個重復序列約52個氨基酸，構成3個α-螺旋[18]，其中第2和第3螺旋(R2和R3)形成 HLH(Helix-Loop-Helix)結構與目標基因結合[19]。本研究獲得的三色堇MYB轉錄因子全部包含上述的R序列，共有61個1R-MYB、57個R2R3-MYB、3個3R-MYB類轉錄因子，符合MYB轉錄因子基因家族的基本結構特征。在大部分MYB轉錄因子中，N端保守性更高，C端序列具有可變性，負責蛋白質活性調節，MYB轉錄因子具有通過其保守的N端結構域轉錄調節C端結構域參與復雜的生理過程[20]，這與本研究中三色堇MYB轉錄因子的大部分motif 元件集中、規律地分布在N端，少數無規律地分布在 MYB 的C端的保守基序結構特點一致，表明MYB基因家族可以通過其特殊的保守結構域進行識別以及對基因功能產生影響。

R2R3-MYB是目前研究最廣的轉錄因子，參與植株生長發育、代謝調節、表皮細胞形態分化等功能調控[21]。本研究中將三色堇57個R2R3-MYB與擬南芥共同進行系統發育進化分析，其中一些三色堇轉錄因子與擬南芥處于同一分支， 表明這2個物種的MYB基因家族具有部分相同的進化過程。一般來說，聚集在同一個分支的基因親緣關系相近，其在功能上也具有相似性，如居利香等利用該方法認證多個與辣椒相關的轉錄因子，其中CaMYB141、CaMYB71與擬南芥亞組20中的AtMYB2聚為一類，認為CaMYB141、CaMYB71與AtMYB2功能相似，均可在干旱條件下增加辣椒素含量[22]。本研究中，三色堇中的VwMYB48、VwMYB53、VwMYB47、VwMYB52與擬南芥亞組4中的AtMYB3、AtMYB4、AtMYB7、AtMYB32聚為一類，表明三色堇中VwMYB48、VwMYB53、VwMYB47、VwMYB52可能參與植物生長過程中的生物協迫與非生物脅迫調節過程[23]。VwMYB40、VwMYB35與擬南芥亞組1中的AtMYB30、AtMYB96關系最近，AtMYB30、AtMYB96與激素調節有關，且主要關于脫落酸與水楊酸，而脫落酸影響花青素的合成[24]，推測三色堇中VwMYB40、VwMYB35通過調節激素的合成從而影響花青素的合成。同理，三色堇中VwMYB39、VwMYB36、VwMYB43、VwMYB41與擬南芥第七亞組中的AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111聚為一類，已有研究表明AtMYB11、AtMYB12、AtMYB111與黃酮醇生物合成相關[25]，因此VwMYB39、VwMYB36、VwMYB43、VwMYB41也可能參與三色堇中黃酮醇生物合成，調節植物代謝活動。VwMYB51、VwMYB54與擬南芥亞組6中的AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113、AtMYB114最相近，而AtMYB75、AtMYB90、AtMYB113、AtMYB114是控制植物花青素合成的基因[26]，表明三色堇的花色形成可能受到VwMYB51、VwMYB54調節，這2個轉錄因子可能參與三色堇花青素合成[27]。但是，有一部分三色堇MYB與擬南芥分支不同，如A1分支不含有任何AtMYB，這種轉錄因子的特異性可能是物種后期進化分離導致[28]。當然，上述論述只是基于基因結構相似性的推測，是否具有相應的功能及其作用機制，還需要進一步研究闡明。