LncRNA TUG1在糖尿病腎病患者中的表達及臨床意義

陳昕彥 于 萌 李 湘 許靜宜 林奕辰 劉曉丹 王 璐

作者單位： 116000 遼寧大連 大連大學附屬中山醫院骨質疏松科

2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus, T2DM)是一種糖代謝紊亂的疾病，可引發T2DM腎病，若不積極治療，可發生腎纖維化，導致死亡[1-2]。因此，尋找與T2DM腎病發病相關的因素，及時干預，改善T2DM腎病患者生存狀況有積極意義。既往研究[3-4]顯示，T2DM腎病發病與微小RNA(microRNA, miRNA)、氧化應激、糖代謝紊亂、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)等相關。研究[5]發現，LncRNA牛磺酸上調基因1(LncRNA taurine up-regulated gene 1，LncRNA TUG1)在T2DM腎病中表達呈低表達，其可能通過抑制微小RNA-21(microRNA-21, miR-21)表達，進而影響T2DM腎病病理發展。秦鳳等[6]研究顯示，miR-21在T2DM腎病患者中呈高表達，其可作為評估T2DM腎病患者病情嚴重程度的輔助指標。但LncRNA TUG1在T2DM腎病患者中的表達水平及其與miR-21的相關性尚不明確。因此，本文通過測定LncRNA TUG1在T2DM腎病患者血清中的表達水平，旨在分析LncRNA TUG1與miR-21表達水平的相關性及其診斷T2DM腎病的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年8月大連大學附屬中山醫院收治的82例T2DM腎病患者為T2DM腎病組，男性42例，女性40例，年齡41～79歲，平均(61.65±12.73)歲。另選取同期T2DM無腎病患者80例為單純T2DM組，男性39例，女性41例，年齡41～80歲，平均(62.04±12.91)歲。納入同期體檢健康者82例為健康組，男性43例，女性39例，年齡40～79歲，平均(59.72±12.56)歲。單純T2DM組患者納入標準：①患者符合《中國2型糖尿病防治指南(2013年版)》[7]中T2DM的診斷標準；②不伴有腎病。T2DM腎病組患者納入標準：①患者符合《糖尿病腎病防治專家共識(2014年版)》中T2DM腎病的判定標準[8]，經實驗室檢查確診；②患T2DM時間>5年。單純T2DM組、T2DM腎病組患者排除標準：①患有I型糖尿病者；②妊娠患者；③有透析、腎移植、膜性腎病史者；④有免疫球蛋白A腎病、高血壓腎病或其他原發性/繼發性腎病者；⑤臨床資料不齊全者；⑥合并腦血管、心、肝功能異常者；⑦合并甲狀腺疾病、腫瘤、感染性疾病者；⑧出現血尿者。受試者對本研究知情同意。本研究符合《赫爾辛基宣言》，經本院倫理委員會批準(批號：20180117)。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 收集受試者空腹外周靜脈血3～5 mL，自然凝集28～32 min，分離血清(4 500 r/min離心6 min，離心半徑為8 cm)，分裝，于-70℃冰箱儲存。

1.2.2 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測血清LncRNA TUG1、miR-21表達水平 冰上解凍血清樣本，利用TRIzol Reagent(15596018，美國GIBCO公司)獲取血清樣本總RNA；按High Capacity RNA-to-cDNA Kit(4489328C，美國Thermo公司)說明書合成cDNA；最后，利用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(XY-TYB-QPK-201，日本Cosmo Bio公司)、qRT-PCR儀(StepOne TM，美國ABI公司)擴增cDNA，獲得循環閾值(CT值)。qRT-PCR儀參數：97.8℃ 8 min，95℃ 40 s，58.5℃ 20 s，62℃ 15 s，40個循環。LncRNA TUG1以GAPDH為內參，miR-21以U6為內參，引物序列見表1。LncRNA TUG1、miR-21相對表達量以2-ΔΔCT法計算。

表1 LncRNA TUG1、GAPDH、miR-21、U6引物序列

1.2.3 觀察指標 ①比較3組研究對象臨床資料(年齡、性別構成比等)、收集3組對象糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin, HbA1c)、估計腎小球濾過率(estimated glomeruar filtration rate, eGFR)、身體質量指數(body mass index, BMI)、血清肌酐(serum creatinine, SCr)、空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、蛋白尿等資料，及血清LncRNA TUG1、miR-21水平；②分析血清LncRNA TUG1對T2DM腎病的診斷價值。

2 結果

2.1 3組對象一般資料比較 與健康組相比，單純T2DM組、T2DM腎病組患者HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿水平升高(P<0.05)，eGFR水平降低(P<0.05)；與單純T2DM組相比，T2DM腎病組患者SCr、蛋白尿水平升高(P<0.05)，eGFR水平降低(P<0.05)。3組對象年齡、BMI、性別差異無統計學意義(P>0.05)，基線資料可比。見表2。

表2 3組對象一般資料比較

2.2 3組對象血清LncRNA TUG1、miR-21表達水平比較 與健康組相比，單純T2DM組、T2DM腎病組患者血清LncRNA TUG1表達水平降低(P<0.05)，血清miR-21表達水平升高(P<0.05)；與單純T2DM組相比，T2DM腎病組患者血清LncRNA TUG1表達水平降低(P<0.05)，血清miR-21表達水平升高(P<0.05)。見表3。

表3 3組對象血清LncRNA TUG1、miR-21表達水平比較

2.3 T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1、miR-21表達水平與HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿的相關性 Pearson相關性分析顯示，T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達水平與HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈負相關(P<0.05)，與eGFR呈正相關(P<0.05)；T2DM腎病患者血清miR-21表達水平與HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈正相關(P<0.05)，與eGFR呈負相關(P<0.05)。見表4。

表4 T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1、miR-21表達水平與HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿的相關性

2.4 T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達水平與miR-21的相關性 Pearson相關法分析顯示，T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達水平與miR-21呈負相關(r=-0.587，P<0.05)。見圖1。

圖1 T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達水平與miR-21的相關性(n=82)

2.5 血清LncRNA TUG1水平對T2DM腎病的診斷價值 以血清LncRNA TUG1為檢驗變量，以 T2DM腎病是否發生為狀態變量，繪制ROC曲線，結果顯示，血清LncRNA TUG1診斷T2DM腎病的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.871(95%CI:0.812～0.930)，截斷值為0.63，約登指數為0.695，其靈敏度為81.7%，特異度為87.8%。見圖2。

圖2 血清LncRNA TUG1診斷T2DM腎病的ROC曲線

3 討論

T2DM腎病是T2DM的一種并發癥，其以腎小球硬化為特征，可出現蛋白尿，嚴重損害患者身心健康[9-10]。因此，積極探討T2DM腎病的發病機制，有利于尋找診斷T2DM腎病的標志物及治療靶點。

LncRNA是一類非編碼RNA分子，長度約為200 nt，其可調控氧化應激，調節上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，介導自噬，影響信號轉導，參與內質網應激過程，與T2DM、高血壓、T2DM腎病等關系密切[11-12]。研究[13]發現，LncRNA TUG1在T2DM腎病中表達失調，其可能通過影響內質網應激反應，進而影響腎上皮細胞損傷，LncRNA TUG1具有診斷T2DM腎病的潛在價值。Meng等[14]研究發現LncRNA TUG1可能通過影響相關信號通路，抑制腎小管上皮細胞凋亡，從而改善T2DM腎病病變進程，IncRNA TUG1可能是治療T2DM腎病的潛在靶標。本研究中,T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達水平低于單純T2DM患者及健康者，與Meng等[14]研究趨勢一致，提示LncRNA TUG1可能與T2DM腎病病理過程密切相關，推測LncRNA TUG1可能通過影響相關信號轉導，調節內質網應激反應，進而影響T2DM腎病發生發展，其機制仍需深入探討。本研究顯示，T2DM腎病患者HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿水平高于健康者，SCr、蛋白尿水平高于單純T2DM患者，eGFR水平低于單純T2DM患者及健康者，提示T2DM腎病患者存在血糖紊亂及腎損傷。進一步研究發現，T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達水平與HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈負相關，與eGFR呈正相關，提示LncRNA TUG1可能與血糖、腎功能共同影響T2DM腎病病變過程。此外，本文還利用ROC曲線分析了血清LncRNA TUG1診斷T2DM腎病的價值，結果顯示，血清LncRNA TUG1診斷T2DM腎病的AUC為0.871，當血清LncRNA TUG1相對表達量<0.63時，T2DM腎病發生概率較大，提示LncRNA TUG1對T2DM腎病有一定診斷價值，測定血清LncRNA TUG1水平有助于臨床診斷T2DM腎病。

miRNA是一類非編碼RNA小分子，可參與信號轉導，影響內質網應激，調節氧化應激過程，與T2DM、糖尿病視網膜病變、T2DM腎病等有關[15-16]。研究[17]發現，miR-21作為miRNA的一員，其在T2DM腎病中呈高表達，下調miR-21可抑制T2DM腎病的發展及腎纖維化，miR-21可能是治療T2DM腎病的潛在靶標；另外，miR-21在T2DM腎臟疾病患者中表達水平較高，其可能在T2DM腎臟疾病患者發生腎纖維化過程中起促進作用[18]。本文中，T2DM腎病患者血清miR-21表達水平高于單純T2DM患者、健康者，與秦鳳等[6]研究趨勢相符，提示miR-21可能參與T2DM腎病病理變化，分析原因，miR-21作為miRNA的成員之一，其可能通過調節氧化應激，影響相關信號轉導過程，進而在T2DM腎病中起促進作用，但其機制有待進一步研究。另外，本研究顯示，T2DM腎病患者血清miR-21表達水平與HbA1c、SCr、FBG、蛋白尿呈正相關，與eGFR呈負相關，提示miR-21可能與血糖、腎功能協同影響T2DM腎病病理發展。此外，本文還分析了T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達水平與miR-21的相關性，結果顯示，LncRNA TUG1表達水平與miR-21呈負相關，提示LncRNA TUG1可能與miR-21共同影響T2DM腎病發生發展，但具體機制需結合基礎研究加以證實。

綜上所述，T2DM腎病患者血清LncRNA TUG1表達水平較低，其與miR-21、HbA1c、eGFR、SCr、FBG、蛋白尿顯著有關，LncRNA TUG1可能是診治T2DM腎病的分子靶標。但本研究未深入探討LncRNA TUG1、miR-21在T2DM腎病中的機制，樣本較少，且未分析miR-21診斷T2DM腎病的價值，后期將從多角度進行深入研究，為臨床診治T2DM腎病提供更有力參考。