桑葉烏龍茶制作工藝流程中生物活性物質的穩定性研究

孫 茂 邱國祥 李景新 鐘楊生 陳芳艷 林健榮 李文楚

（1.華南農業大學動物科學學院蠶絲科學系 廣東廣州 510642；2.廣東省絲綢紡織集團有限公司 廣東廣州 510180； 3.廣東省倫教蠶種場 廣東順德 528308）

根據原國家衛生和計劃生育委員會批準的新食品原料和一般食品的公告，桑葉提取物可用作新的食品原料。研究表明，桑葉提取物可通過誘導脂肪細胞凋亡、抑制前脂肪細胞分化與肝脂肪再生來改善肥胖癥，同時具有抗組胺與抗關節炎、延年益壽的作用，能夠降低糖尿病、心血管疾病、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌與胃腸道癌的發病率，且對神經系統與心理效應存在潛在機制[1]。

由桑葉制成的桑葉茶的主要功能組分包括桑多糖、DNJ、茶多酚、游離氨基酸等生物有效成分，活性成分多，藥食同源[2]。茶多酚是桑葉茶抗氧化性能的關鍵成分[3]，茶多酚的抗氧化特性可保護人體免受氧化損傷，其主要通過捕獲超氧自由基、單線態氧、羥基等自由基、過氧自由基、一氧化氮、二氧化氮和過氧亞硝酸鹽，減少它們對無細胞系統的脂質膜、蛋白質和核酸的損傷[4]。其中，EGCG與大多數活性氧反應是最有效的。茶多酚具有抗氧化活性的化學結構包括鄰二羥基或三羥基結構，它能螯合金屬離子，防止自由基的生成，這種結構也允許電子離域，賦予高反應活性，以淬滅自由基，因此茶多酚對脂蛋白氧化的保護作用被認為有助于預防動脈粥樣硬化和其他心血管疾病。然而，在某些條件下，茶多酚也可能會發生自氧化。

由桑葉制成的桑葉烏龍茶除了含有茶多酚之外，還含有桑多糖、桑多酚、黃酮、游離氨基酸等多種活性物質有效成分。桑葉烏龍茶提取物對大腸桿菌活性存在抑制機制，且效果優于抗生素[5-6]。隨著患糖尿病與肥胖癥的人數日益增加，桑葉烏龍茶在糖尿病患者和肥胖患者的營養和飲食領域具有較高的研究價值和發展前景[7]。

研究表明，桑葉烏龍茶的加工工藝可以提高桑葉的可溶性糖、氨基酸、黃酮和水浸出物的含量，降低多酚類物質含量。江山（2012）在桑葉茶中檢測出42種揮發性成分，其中α-紫羅蘭酮、苯乙醇、α-黃酮、芐醇和芳樟醇是桑葉茶的主體揮發性香味成分，萜烯類和酯類物質具有令人愉悅的芳香氣味，但含量較低[8]，含量較高的化合物為醛類和酮類[9]。仰勇等（2021）發現不同葉位制作的桑葉烏龍茶總多酚含量具有顯著差異，而總多糖含量、游離氨基酸總量和水浸出物含量無顯著差異[10]。

課題組前期對桑葉烏龍茶制作工藝流程與品質，包括干物質和水分含量進行了分析[11]，并對桑葉烏龍茶制作工藝流程的加工參數進行了優化[12]。本實驗則主要研究桑葉烏龍茶制作工藝流程中生物活性物質的穩定性，以期探究不同的制茶工藝對茶多酚、可溶性總糖和游離氨酸含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料采集

試驗選取桑樹品種為沙2×109，屬于果桑與葉桑兼用桑。桑葉樣品由廣東省倫教蠶種場提供，采集地點位于臺山市廣海鎮廣東省倫教蠶種場蠶桑大健康生產科研示范基地，采摘時間為2018年5月3日7：00—11：00和13：00—18：30。采用四分法進行采樣，試樣平攤于地面，用取樣鏟取出樣品約2 kg作為原始樣品，在帶蓋的特殊茶盒中混合，并通過四分法逐漸減少至1 kg，作為平均樣品，分裝于兩個包裝袋中，抽真空4 ℃保存供試驗與檢驗用。

1.2 桑葉烏龍茶制作工藝流程

桑葉烏龍茶的制作總體工藝流程：桑葉采摘→切葉（一分為二）→殺青→揉壓→烘焙→密封→貯藏。

將采集的桑葉平均分為四組，其中設置處理1，輕殺青、輕烘干；處理2，輕殺青、重烘干；處理3，重殺青、輕烘干；處理4，重殺青、重烘干。各處理的條件參數如表1所示，根據流程進行桑葉烏龍茶制作。

表1 各處理殺青、揉制和烘焙工藝參數

桑葉烏龍茶制作完成后，用粉碎機將各組試樣磨碎過篩后作為待測試樣，密封保存于4 ℃冰箱中。

1.3 生物活性物質含量測定方法

1.3.1 茶多酚含量測定

參見GB/T 8313-2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》的方法，但根據試驗流程進行適當修改。

（1）制作沒食子酸標準曲線

分別移取1.0 mL沒食子酸系列工作液和水（作為空白對照）到刻度試管中，隨后用移液槍分別加入5.0 mL福林酚試劑，混勻并反應5 min，加入4.0 mL 7.5%的Na2CO3溶液，混勻，室溫下靜置60 min。用10 mm比色皿在765 nm波長條件下測量吸光度（A）。以每種工作液的沒食子酸濃度為橫坐標，沒食子酸系列工作液的吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

（2）測定樣品茶多酚含量

供試液母液：稱取0.4000 g粉碎樣品于10 mL離心管中（避免試樣殘留管口），然后加入在70 ℃水浴中預熱過的70%的甲醇溶液5 mL（槍口與管口成角度加樣），混勻儀混勻，立即移入70 ℃水浴，浸提10 min（隔5 min混勻1次）后室溫冷卻30 min，在3500 r/min轉速下離心10 min（管口要蓋嚴），隨后將上清液轉移至10 mL容量瓶中。殘渣再次重復以上操作提取。合并浸出液后冷卻，稀釋至10 mL搖勻，用注射器經0.45 μm過濾器過濾至新的離心管中待用（在4 ℃下最多可保存24 h）。

待測液：用移液管將1.0 mL母液移取至100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度搖勻，待測。

待測液重復制作標準曲線的操作，并通過標準曲線確定待測液中茶多酚的濃度。

茶多酚含量以質量分數（%）表示，計算公式如下：

式（1）中：A為吸光值；V為試樣提取液體積，10 mL；d為稀釋系數；SLOPEstd為沒食子酸標準曲線的斜率；ω為試樣干物質含量（%）；m為試樣質量，單位為克（g）。

在重復條件下，同一樣品獲得的測定值之間的絕對差值不應超過算術平均值的2%。

1.3.2 游離氨基酸含量測定

游離氨基酸含量的測定參見GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測定》的方法，但根據試驗流程進行適當修改。

（1）制作谷氨酸標準曲線

10 mg/mL谷氨酸標準儲備液制備：準確稱量0.25 g谷氨酸（純度不低于99%），加入適量水溶解，玻璃棒轉移至25 mL容量瓶中，加水至標線下1 cm～2 cm處，冷卻至室溫定容搖勻待用。

用移液槍分別移取0.0 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL谷氨酸標準儲備液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻待用。該系列標準工作液1 mL分別含有0 mg、0.2 mg、0.3 mg、0.4 mg、0.5 mg、0.6 mg谷氨酸。用移液槍將1 mL谷氨酸系列標準工作液分別移入6支25 mL比色管中，隨后加入0.5 mL pH8.0磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%茚三酮溶液，充分混合，管口封嚴，在沸水浴中加熱15 min（沸騰時開始計時），冷卻30 min，加水至25 mL。靜置10 min后，用5 mm比色皿在570 nm波長條件下測定吸光度（A）。以每種谷氨酸標準工作液的濃度為橫坐標，谷氨酸系列標準工作液的吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

（2）測定樣品游離氨基酸含量

準確稱量1.500 g粉碎樣品于250 mL三角瓶中（避免試樣殘留瓶口），加入225 mL沸蒸餾水混勻，蓋上橡膠玻璃管（冷凝回流），立即轉移到沸水浴中浸提45 min（每隔10 min混勻1次）。浸出后立即減壓趁熱過濾（高溫防止燙手）。隨后，用少量沸蒸餾水將茶渣洗滌3次，將濾液轉移至250 mL容量瓶中，冷卻30 min，用水稀釋至刻度，搖勻待測。

移液槍準確吸取1 mL待測液與1 mL蒸餾水（作為空白對照），重復制作標準曲線的操作步驟，用紫外分光光度計測定吸光度（A）。通過標準曲線，求得待測液的游離氨基酸濃度。

游離氨基酸含量以干態質量分數（%）表示，計算公式如下：

式（2）中：C為測定的吸光度通過標準曲線計算所得的毫克數（mg）；V1為待測液體總體積，單位為毫升（mL）；V2為測定時測定溶液的體積，單位為毫升（mL）；m為粉碎試樣的質量，單位為克（g）；ω為試樣干物質含量（%）。

在重復條件下，同一樣品獲得的測定值之間的絕對差值不應超過算術平均值的10%。

1.3.3 可溶性總糖含量測定

參考蒽酮比色法測定可溶性總糖含量，但根據試驗流程進行適當修改。

（1）制作葡萄糖標準曲線

取7支潔凈試管，用移液槍準確移取0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL葡萄糖標準儲備液，再分別加蒸餾水1 mL、0.9 mL、0.8 mL、0.7 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL混勻待用，該系列標準工作液1 mL分別含有0 μg、10 μg、20 μg、30 μg、40 μg、60 μg、80 μg葡萄糖。

將每支試管迅速浸于冰水浴中，立即準確加入蒽酮試劑4.0 mL，搖勻（管口蓋嚴，以防蒸發），各管均浸于沸水浴中10 min（自重新煮沸起計時），流水冷卻2 min，在室溫下靜置反應10 min，并使用10 mm比色皿在620 nm波長條件下測定吸光度（A）。以每種葡萄糖標準工作液的濃度為橫坐標，相對應的吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

（2）測定樣品可溶性總糖含量

準確稱量0.800 g粉碎樣品于50 mL三角瓶中（避免試樣殘留瓶口），加入25 mL沸蒸餾水混勻，蓋上橡膠玻璃管（冷凝回流），立即轉移到沸水浴中浸提10 min。浸出后立即減壓趁熱過濾（高溫防止燙手）。隨后，用少量沸蒸餾水將茶渣洗滌3次，將濾液轉移至50 mL容量瓶中，冷卻30 min，用水稀釋至刻度，搖勻。再用移液槍吸取提取液2 mL，至另一50 mL容量瓶中，蒸餾水稀釋定容至刻度，搖勻待測。

移液槍準確吸取1 mL已稀釋的提取液和蒸餾水（作為空白對照）于大試管中，迅速浸于冰水浴，立即準確加入4.0 mL蒽酮試劑，以下操作同標準曲線制作流程。用紫外分光光度計測定吸光度（A），并通過標準曲線，求得待測液可溶性總糖濃度。

可溶性總糖含量以質量分數（%）表示，計算公式如下：

式（3）中：m1為測定的吸光度通過標準曲線計算所得的微克數（μg）；d為稀釋倍數；m為粉碎試樣的質量，單位為克（g）。

在重復條件下，同一樣品獲得的測定值之間的絕對差值不應超過算術平均值的5%。

2 結果與分析

2.1 茶多酚含量變化

根據沒食子酸系列標準工作液的吸光度（A）測定結果建立散點圖，得出回歸方程為y=0.0114x-0.0026，相關系數R2=0.9930，擬合度良好[12]，可做標準曲線。

測定了4種不同工藝條件下（輕殺青、輕烘干；輕殺青、重烘干；重殺青、輕烘干；重殺青、重烘干）的茶多酚含量，結果如圖1所示。輕殺青與重殺青對茶多酚含量的影響差異不顯著（P＞0.05），重殺青的茶多酚含量為0.52%，輕殺青的茶多酚含量為0.86%；輕烘干與重烘干對茶多酚含量的影響差異不顯著（P＞0.05），重烘干的茶多酚含量為0.81%，輕烘干的茶多酚含量為0.74%?？傮w相比，烘干后的茶多酚含量為0.78%，殺青后的茶多酚含量為0.52%。

圖1 不同處理的茶多酚含量

2.2 游離氨基酸含量變化

根據谷氨酸系列標準工作液的吸光度（A）測定結果建立散點圖，得出回歸方程為y=1.3459x-0.0348，相關系數R2=0.9919，擬合度良好，可做標準曲線。

測定了4種不同工藝條件下（輕殺青、輕烘干；輕殺青、重烘干；重殺青、輕烘干；重殺青、重烘干）的游離氨基酸含量，結果如圖2所示。重殺青的游離氨基酸含量為0.16%，輕殺青的游離氨基酸含量為0.19%，輕殺青與重殺青對游離氨基酸含量的影響差異顯著（P＜0.05）；輕烘干與重烘干對游離氨基酸含量的影響差異不顯著（P＞0.05），重烘干的游離氨基酸含量為0.17%，輕烘干的游離氨基酸含量為0.18%?？傮w相比，烘干后的游離氨基酸含量為0.17%，殺青后的游離氨基酸含量為0.18%。

圖2 不同處理的游離氨基酸含量

2.3 可溶性總糖含量變化

根據葡萄糖系列標準工作液的吸光度（A）測定結果建立散點圖，得出回歸方程為y=0.0032x+0.0046，相關系數R2=0.9947，擬合度良好，可做標準曲線。

測定了4種不同工藝條件下（輕殺青、輕烘干；輕殺青、重烘干；重殺青、輕烘干；重殺青、重烘干）的可溶性總糖含量，結果如圖3所示。輕殺青與重殺青對可溶性總糖含量的影響差異顯著（0.01＜P＜0.05），重殺青的可溶性總糖含量為26.40%，輕殺青的可溶性總糖含量為19.65%；輕烘干與重烘干對可溶性總糖含量的影響差異不顯著（P＞0.05）。重烘干的可溶性總糖含量為24.74%，輕烘干的可溶性總糖含量為23.74%?？傮w相比，烘干后的可溶性總糖含量為24.24%，殺青后的可溶性總糖含量為20.61%。

圖3 不同處理的可溶性總糖含量

3 討論

傳統桑葉烏龍茶制作方式中，采用殺青1次，揉壓2次后再進行第二次殺青，其中揉壓過程中會出現很多綠色汁液。本試驗采用滾筒殺青，便于進行規?；a，更易于殺青透徹，茶質柔軟，適于揉壓。蒸汽殺青會造成活性成分的大量流失，而鍋炒殺青炒翻不均勻，易造成桑葉茶青澀味過重[12]。但汁液的成分和后期殺青過程中出現的大量桑葉茶粉，本試驗未進行分析。殺青與烘焙的過程其實是酚類物質[13]、酶類[14]、芳香物質的復雜化學反應過程。殺青根據機械加工方式的不同可分為鍋炒殺青、蒸青、滾筒殺青、微波殺青等。尹志亮等（2015）發現蒸青和炒青處理可使游離氨基酸得到有效的保留，保留率可達85%以上，采用炒青處理可以保留更多的γ-氨基丁酸（GABA），保留率為73.58%，而蒸青為52.24%；而且低火處理的氨基酸和GABA含量分別達92.41%和62.16%，比高火處理分別高3.42%和8.23%；此外，對桑葉烏龍茶中多糖及茶水浸出物含量的影響差別不大[15]。

本試驗輕殺青與重殺青對茶多酚含量的影響差異不顯著（P＞0.05），結論與尹志亮等基本一致[15]，同時也說明通過改變殺青溫度難以實現茶多酚含量顯著變化，但輕殺青比重殺青的茶多酚含量高，是由于殺青溫度的升高，茶多酚反應生成非酚類物質而造成損失。輕烘干與重烘干對茶多酚含量的影響差異不顯著（P＞0.05），說明在相同烘焙溫度條件下，通過改變烘焙時長難以實現茶多酚含量顯著變化，但重烘干比輕烘干的茶多酚含量高，是由于隨著烘焙時間的延長，非酚類物質通過多酚氧化酶催化氧化以及部分聚合作用轉化為酚類物質，同時解釋了重烘干湯色比輕烘干湯色厚重的原因。烘焙后比殺青后的茶多酚含量高，再次證明烘焙在制茶工藝中的關鍵作用。桑葉烏龍茶中含有大量酚類物質，其主要通過增加類脂質的通路促進血脂的降低[16]，其次還具有誘導解毒酶[6]、治療動脈粥樣硬化病[17]、抗氧化[18]等功效，由于酚類物質具有顯色功能[19]，為其湯色較重提供了數據支撐。

輕殺青與重殺青對可溶性總糖含量的影響差異未達到極顯著水平（0.01＜P＜0.05），說明通過改變殺青溫度使可溶性總糖含量發生了一定變化，在實際操作流程中，要嚴格控制殺青溫度，且重殺青比輕殺青的可溶性總糖含量高，是由于殺青溫度的升高，造成更多非可溶性糖或其他物質反應生成可溶性糖[20]。輕烘干與重烘干對可溶性總糖含量的影響差異不顯著（P＞0.05），說明在相同烘焙溫度條件下，通過改變烘焙時長難以實現可溶性總糖含量的顯著變化，但重烘干比輕烘干的可溶性總糖含量高，可能是由于隨著烘焙時間的延長，非可溶性糖或其他物質反應生成可溶性糖，且烘焙后比殺青后的可溶性總糖含量高。桑葉烏龍茶中的可溶性總糖具有顯著的降血糖功效[21]，主要是通過促進胰島B細胞分泌胰島素來實現[22-23]，且含量比參考文獻中其他制茶方式高，為桑葉烏龍茶回甘特性與桑葉青澀味淡提供數據支撐。

輕殺青與重殺青對游離氨基酸含量的影響差異同樣未達到極顯著水平（0.01＜P＜0.05），說明通過改變殺青溫度，游離氨基酸含量發生了一定變化，在實際操作流程中，要嚴格控制殺青溫度，且輕殺青比重殺青的游離氨基酸含量高，可能是由于殺青溫度的升高，造成游離氨基酸參與其他物質反應被消耗。輕烘干與重烘干對游離氨基酸含量的影響差異不顯著（P＞0.05），說明在相同烘焙溫度條件下，從工藝上考慮，通過改變烘焙時長難以實現游離氨基酸含量顯著變化，但輕烘干比重烘干的游離氨基酸含量高，證明隨著烘焙時間的延長，會造成游離氨基酸的流失，因而烘焙時間不宜過久。烘焙后比殺青后的茶多酚含量高，可見烘焙雖然操作簡單但作用極其重要。此次試驗中游離氨基酸與茚三酮共熱反應生成棕色產物，并非藍紫色產物，說明桑葉烏龍茶中的游離氨基酸主要成分為谷氨酰胺與天冬酰胺。相較于其他茶葉，桑葉烏龍茶中含有更多游離氨基酸[20]，這與其具有抗疲勞[24]、增強機體免疫力[25]等功效的研究結果相一致。