紅景天苷通過激活PI3K/Akt和抑制NF-κB信號通路改善川崎病冠狀動脈損傷

胡琳 楊艷娟 李潔瀅 周忠 田正 焦蓉

湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院兒科（湖北 襄陽 441000）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種好發于5歲以下兒童的免疫性血管炎，若未得到及時的治療，可發生多種并發癥，其中最嚴重的是冠狀動脈損傷（coronary arterylesion，CAL），其病因及發病機制尚未明確，目前的研究提示可能與感染、血管內皮損傷等因素有關［1-2］。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路參與細胞內多種信號轉導途徑，也參與炎癥及氧化應激的調控［3］，郭鑫等［4］認為PI3K/Akt信號通路激活后對KD冠狀動脈內皮細胞損傷具有保護作用。核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路在KD中起著很重要的作用，該通路的激活可產生一系列級聯反應引起細胞因子風暴，可促使炎癥因子如白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-8（IL-8）及黏附分子如血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）等的產生，并介導中性粒細胞的聚集、浸潤，血管通透性增加，最終導致冠狀動脈損傷［5-7］。氧化應激與很多疾病的發生有關，與人體內抗氧化系統處于動態平衡之中，若這種平衡關系被破壞就會產生氧化應激損傷，導致活性氧（ROS）過度表達及抗氧化酶如谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，進一步導致血管內皮細胞功能異常［8］。因此，減輕急性期炎癥反應、保護血管內皮結構和功能完整或許對KD合并CAL的防治有一定的幫助。

目前KD的經典治療方案是丙種球蛋白和阿司匹林聯合用藥，但仍有部分患者對丙種球蛋白治療無反應［9-10］，因此尋找輔助治療藥物極為重要，有學者建議使用天然藥物作為川崎病的輔助治療［11］。

紅景天苷（Salidroside，Sal）是植物紅景天的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等多種特點，可通過抑制炎癥、氧化應激等發揮保護內皮功能的作用［12］。盡管紅景天苷有如此多的生物學作用，但在KD中紅景天苷是否可以通過PI3K/Akt和NF-κB信號通路減輕炎癥反應和氧化應激水平發揮冠狀動脈保護作用尚未見相關報道。

依據目前國內外已建立的KD內皮細胞模型［13-14］，本研究將沿用腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導人冠狀動脈內皮細胞（HCAEC）這一方法來建立KD冠狀動脈損傷細胞模型，并探討紅景天苷對人冠狀動脈內皮細胞（HCAEC）炎癥反應和氧化應激損傷的保護作用及其機制，期望為川崎病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HCAEC細胞購自于Otwo Biotech；TNF-α購自于Pepro Tech；Sal購自MCE；高糖DMEM培養液和胎牛血清購自Gibco；CCK-8試劑盒購自Biosharp；逆轉錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒購自Takara；ROS檢測試劑盒購自Solarbio，SOD及GSH-px分析試劑盒購自南京建成；抗p-PI3K85（Bioss）；抗 p-NF-κBp65（Wanleibio）；抗 p-Akt（Affinity）；抗IL-6、IL-1β、ZO-1及VE-cadherin（Proteintech）。引物設計及合成由武漢金開瑞生物工程有限公司完成。本研究已經過湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院倫理委員會審批（審查批號：XYYYE20210030號）

1.2 細胞培養與分組 在HCAEC中加入含10%胎牛血清的高糖培養液，并置于37℃、5%CO2培養箱內，每隔24 h進行換液，每3天傳代一次。將對數生長期的HCAEC細胞隨機分為Con組、TNF-α組、TNF-α+50 μmol/L Sal組、TNF-α+100 μmol/L Sal組。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖活性 將HCAEC（1×104/mL）接種在96孔板中，每孔100 μL。設置不同濃度梯度的紅景天苷（12.5、25、50、100、200 μmol/L）作用24 h，或 TNF-α（5、10、20、40、80 ng/mL）作用6 h，并設立空白對照，每組5個復孔，置于細胞培養箱中培養一定時間后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h，在酶標儀450 nm處測定吸光度值，計算細胞增殖率。

1.4 RT-qPCR法檢測細胞炎癥因子及黏附分子mRNA的表達情況 將HCAEC（1×106/mL）接種于6孔板中，先用40 ng/mL的TNF-α處理細胞6 h，再加或不加50 μmol/L和100 μmol/L的紅景天苷處理24 h，用Trizol試劑提取總RNA，取1 μg總RNA按逆轉錄試劑盒說明逆轉錄成cDNA取2 μL為模板進行PCR。以2-ΔΔCT法進行相對定量分析。實驗中使用的引物見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of the primers

1.5 Western blot法檢測PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的表達情況 按照上述方法鋪板、處理細胞，采用RIPA細胞裂解液于冰浴上提取總蛋白，BCA法定量，加入loadding buffer煮沸10 min。取25 μg等量蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉入PVDF膜，用5%脫脂奶粉進行封閉1.5 h，分別加入一抗（β-actin、p-PI3K、p-Akt、p-P65、VE-cadherin、ZO-1、IL-1β、IL-6）4 ℃孵育過夜后，用TBST漂洗3次，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，用TBST洗滌3次，加入ECL發光顯影，用BIO-RAD凝膠成像系統拍照，分析目的蛋白條帶相對分子質量及灰度值。

1.6 DCFH-DA法觀察細胞ROS生成情況 將HCAEC細胞以2×104個/孔的密度接種于24孔板中，按照上述方法處理細胞，添加2'-7'-二氯二醋酸熒光素（DCFH-DA），在CO2培養箱中孵育20 min，用PBS洗滌細胞3次，在熒光顯微鏡（200×）下觀察綠色熒光，采集圖像并分析各組熒光強度。

1.7 檢測細胞上清液中SOD、GSH-px的活性 將HCAEC細胞以100×104個/孔的密度接種于40 mm培養皿中，按照上述方法處理細胞，收集細胞上清，按照試劑盒說明書檢測各組細胞SOD、GSH-Px活性。

1.8 統計學方法 本文所有實驗均重復3次，采用Graphpad 8.0軟件進行統計學分析，數據采用均數±標準差表示，兩組數據的比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 紅景天苷及TNF-α對HCAEC增殖活性的影響 CCK-8結果顯示，與對照組相比，12.5、25、50、100 μmol/L的Sal對HCAEC的增殖活性沒有影響（P＞ 0.05），而200 μmol/L Sal組細胞增殖活性被顯著抑制（P=0.000 8，圖1A）。與對照組相比，5、10、20 ng/mL TNF-α組細胞增殖活性無明顯變化（P＞0.05），當TNF-α濃度＞40 ng/mL時細胞增殖活性顯著下降（P＜0.000 1，圖1B）。于是選用50、100 μmol/L 的 Sal和 40 ng/mL的TNF-α 用于后續實驗。

圖1 紅景天苷及TNF-α對HCAEC增殖活性的影響Fig.1 Effect of Salidroside and TNF-α on the viability of HCAEC

2.2 紅景天苷抑制炎癥因子及黏附分子的表達 RT-qPCR結果顯示，與對照組相比，40 ng/mL的TNF-α可促進HCAEC細胞炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β和黏附分子ICAM-1、VCAM-1的mRNA表達（P＜ 0.000 1），而50、100 μmol/L的Sal處理后這些炎癥因子及黏附分子的mRNA表達水平顯著下降（P＜ 0.05，圖2）。

圖2 紅景天苷對TNF-α誘導的HCAEC炎癥因子和黏附分子的影響Fig.2 Effect of Salidroside on TNF-α-induced HCAEC inflammatory factors and adherent molecules

2.3 紅景天苷對PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的影響 Western blot結果顯示，與對照組相比，TNF-α作用6 h后，HCAEC細胞中p-PI3K（P=0.004 1）、p-Akt（P=0.025 2）的蛋白表達水平降低，同時p-P65、IL-6、IL-1β的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），不同濃度紅景天苷處理后p-PI3K、p-Akt的蛋白水平顯著升高，而p-P65、IL-6、IL-1β的蛋白表達顯著下降（P＜0.05，圖3）。

圖3 紅景天苷對PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關蛋白的影響Fig.3 Effect of Salidroside on PI3K/Akt and NF-κB signaling pathway-related proteins

2.4 紅景天苷改善內皮細胞通透性 Western blot結果顯示，與對照組相比，TNF-α組ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達水平降低（P＜0.05），而紅景天苷可使ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達水平顯著上調（P＜ 0.05，圖4）。

圖4 紅景天苷對ZO-1、VE-cadherin蛋白表達水平的影響Fig.4 Effect of Salidroside on expression levels of ZO-1 and VE-cadherin proteins

2.5 紅景天苷減輕氧化應激損傷 采用DCFH-DA熒光探針檢測各組細胞內ROS含量變化情況如圖5A所示，與對照組相比，TNF-α組的熒光強度顯著增強。而紅景天苷作用之后，熒光強度顯著減弱，提示紅景天苷可減少模型組中ROS的生成。由圖5B-C所知，與對照組比較，TNF-α組細胞內抗氧化酶SOD及GSH-Px活性均顯著下降（P＜0.05），紅景天苷可使SOD及GSH-Px的活性顯著升高（P＜0.05）。

圖5 紅景天苷對HCAEC細胞ROS水平及SOD、GSH-Px活性的影響Fig.5 Effects of Rhodiola rosea on ROS levels and SOD and GSH-Px activities in HCAECs

3 討論

盡管KD被人們認識已有50余年，但KD導致CAL的機制仍未明確，現有的研究［15］發現，CAL與血管內皮功能障礙關系密切。本研究中用KD合并CAL時顯著升高的TNF-α刺激HCAEC作為川崎病冠脈損傷細胞模型，發現多種炎癥因子過度表達、內皮細胞通透性增加，這與川崎病所致CAL病理改變一致［16］，提示成功構建了川崎病冠狀動脈損傷模型。

有研究［11］指出，具有抗炎或免疫調節作用的中藥化學物質可作為KD的潛在治療藥物。小檗堿是中藥黃連的有效成分，已被證明可以減輕KD血清誘導的冠狀動脈內皮功能障礙［17］，而具有類似藥理活性的紅景天苷也被發現能在多種信號途徑中調節細胞因子釋放和蛋白表達，發揮減輕機體炎癥及保護心血管等作用，近幾年紅景天苷在許多疾病如心腦血管疾病、代謝相關等疾病中的作用及作用機制也備受關注［18］。例如，在低壓缺氧誘導的心肌損傷大鼠中，紅景天苷可激活PI3K/Akt信號通路減輕炎癥反應，改善心臟結構和功能［19］。也能抑制NF-κB途徑，促進大鼠軟骨細胞增殖，緩解骨關節炎大鼠軟骨退變［20］。在代謝性疾病中，紅景天苷可通過促進脂肪干細胞增殖分化誘導糖尿病大鼠皮膚創面愈合［21］。推測紅景天苷可通過某些信號途徑在KD合并CAL中發揮保護作用。

研究發現，NF-κB信號通路異常活化可誘導川崎病患兒免疫功能紊亂，并參與CAL的發生［22］。血管內皮鈣黏蛋白（VE-cadherin）是血管內皮細胞之間連接的關鍵分子，其結構和功能異常會造成內皮細胞層通透性增加，進而發生炎癥反應［23］。而緊密連接蛋白（ZO-1）在調節內皮細胞通透性方面起著非常重要的作用，LAI等［24］發現KD合并CAL患者血清中ZO-1的水平降低。在本研究中發現，TNF-α誘導HCAEC細胞后，p-P65蛋白表達水平升高，其下游炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1、VCAM-1的基因表達水平而也顯著升高，這提示NF-κB信號通路被活化后使HCAEC細胞產生炎癥反應。同時也觀察到HCAEC細胞損傷后ZO-1、VE-cadherin的蛋白表達量降低，以致細胞膜上連接蛋白減少，使細胞膜通透性增大促使炎癥發生。使用紅景天苷干預后，上述作用均可被逆轉，因此認為紅景天苷可通過抑制促炎因子的表達、降低細胞膜通透性進而減輕KD冠狀動脈炎癥損傷。

據報道［25］內皮功能障礙是大多數心血管疾病發病的初始步驟，而氧化應激是這一過程的關鍵驅動因素。XU等［17］用KD血清誘導HCAEC細胞建立KD內皮細胞損傷模型，證實了KD氧化應激的發生。同樣，在本研究中觀察到TNF-α作用于HCAEC后，p-PI3K、p-Akt的蛋白表達含量下降，PI3K/Akt信號通路被顯著抑制，同時存在ROS過量表達，GSH-px、SOD的活性下降，這意味著HCAEC細胞發生氧化應激并產生功能障礙，而紅景天苷可對抗這些作用。因此認為紅景天苷發揮內皮細胞保護作用可能是通過激活PI3K/Akt信號通路完成的。

綜上所述，紅景天苷減輕TNF-α誘導的HCAEC細胞炎癥反應和氧化應激水平使冠狀動脈內皮細胞恢復相應功能，可能是通過激活PI3K/Akt和抑制NF-κB信號通路完成的。本研究初步探索了紅景天苷在KD冠狀動脈損傷中的抗炎及抗氧化作用及作用機制，為紅景天苷的臨床應用提供理論依據。但本研究還存在一定的局限性，目前僅涉及細胞實驗，后續本課題組還將繼續完善相關基因的敲除及過表達等實驗深入探究其機制，并在動物實驗中進一步驗證。