柱前衍生化氣相色譜-串聯質譜法檢測平菇中吡蟲啉的殘留量

曲 瀅，查欣欣，沈 鵬，葉 劍，王洪雷

（1.江蘇恒生檢測有限公司，南京 210046；2.江蘇省農藥研究所股份有限公司，南京 210046）

吡蟲啉（Imidacloprid），化學名稱為(E)-1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺（圖1），是一種具有內吸性的新煙堿類殺蟲劑，為后突觸煙堿乙酰膽堿受體（nAChRs）的激動劑，作用于昆蟲中樞神經系統，作用方式為層間傳導，具有觸殺和胃毒作用[1]。吡蟲啉在土壤、動物和植物中均容易發生降解代謝，土壤中最重要的代謝途徑為咪唑啉環羥氧化、還原或失去硝基，水解為6-氯煙酸；在植物體內主要代謝途徑為吡蟲啉通過失去硝基、咪唑啉環羥基化水解為6-氯煙酸（圖2），主要代謝物為吡蟲啉烯烴、吡蟲啉脲、吡蟲啉胍、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸，所有代謝物都含有6-氯-吡啶基部分[2]。

圖1 吡蟲啉結構式

圖2 6-氯煙酸結構式

目前關于吡蟲啉檢測方法較多，主要有液相色譜法、液相色譜串聯質譜法，如采用液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）技術檢測吡蟲啉母體和苯醚甲環唑在蕹菜、秋葵等蔬菜中的殘留[3-8]。并且對吡蟲啉代謝物的研究多為單獨檢測吡蟲啉胍、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸[9-11]。而農藥殘留化學評估時，會同時參考GB 2763—2021[12]和JMPR[3]對殘留的定義，JMPR對評估膳食攝入的吡蟲啉殘留量定義為吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基的代謝物之和。有關基于該定義研究吡蟲啉的檢測方法較少。因此，本研究通過柱前衍生方法，加入N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），將吡蟲啉和代謝物轉化為6-氯煙酸三甲基硅酯（圖3）[3]，通過優化儀器檢測和前處理反應條件等因素，同時對平菇中吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基代謝物的殘留總量進行檢測分析，為吡蟲啉在農藥殘留化學評估的膳食風險攝入評估提供技術支撐。

圖3 6-氯煙酸三甲基硅酯結構式

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料：平菇，江蘇恒生檢測有限公司；99.1%吡蟲啉標準品，北京勤誠亦信科技開發有限公司；99.21%6-氯煙酸標準品，Dr·Ehrenstorfer公司。

試劑：高錳酸鉀、硫酸（分析純），南京化學試劑股份有限公司；N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA）硅烷化試劑，美國Regis公司；甲基叔丁醚、乙腈、正己烷（色譜純），美國天地有限公司；氯化鈉、無水亞硫酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純），科密歐化學試劑有限公司；超純水，默克化工技術有限公司。

儀器：濾膜（0.22 μm，有機系），津騰試驗設備有限公司；氣相色譜-串聯質譜儀，美國安捷倫科技公司；AL204萬分之一天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；AM600刀式研磨儀，螞蟻源科學儀器有限公司；SSW-420-2S電熱恒溫水槽，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 儀器檢測條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；色譜柱溫度：100℃，保持1 min，然后以10℃/min升溫至200℃，再以40℃/min升溫至250℃；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流量：1.0 mL/min；進樣口溫度：250℃；進樣量：1 μL；進樣方式：不分流進樣；保留時間：7.7 min左右；電離方式：EI；電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：250℃；溶劑延遲：3 min；MRM多反應監測；質譜檢測參數見表1。

表1 6-氯煙酸三甲基硅酯質譜檢測參數

1.3 樣品的提取及衍生化

準確稱取2.0 g平菇樣品于50 mL 塑料離心管中，加入5 mL超純水和10 mL乙腈，振蕩20 min，加入5 g氯化鈉，渦旋振蕩1 min后以5 000 r/min離心5 min，定量吸取5 mL上清液于濃縮瓶后濃縮至近干，加入10 mL堿性KMnO4溶液，在70℃水浴反應10 min取出冷卻，溫度低于15℃時，加入10%稀硫酸溶液酸化，加入1 g無水亞硫酸鈉，溶液顏色由紫紅色變為巧克力棕（二氧化錳）后變為無色透明，確定pH＜1；用10 mL甲基叔丁醚（MTBE）液液萃取2次，取全部上清液轉移至氮吹瓶吹干，2 mL正己烷復溶后，加入25 μL MSTFA，渦旋振蕩30 s，反應為6-氯煙酸三甲基硅酯，過0.22 μm有機濾膜進氣相色譜-串聯質譜檢測。

1.4 標準儲備液的配制和衍生化

準確稱取0.010 2 g 6-氯煙酸標準品，用乙腈定容至10 mL，得到質量濃度為1 012 mg/L的標準儲備液，用乙腈稀釋為10 mg/L的標準工作溶液待衍生化；準確移取2 mL 10 mg/L標準工作溶液入氮吹瓶吹干，2 mL正己烷復溶后，加入25 μL MSTFA進行衍生反應為6-氯煙酸三甲基硅酯，于0～4℃保存。

稱取0.010 4 g吡蟲啉標準品，用乙腈定容至10 mL，得到濃度為1 031 mg/L標準儲備液，用乙腈梯度稀釋，配制成質量濃度分別為10和1 mg/L標準工作溶液，制備成0.02、0.05和0.5 mg/kg的添加樣品，于0～4℃保存。

1.5 標準溶液制備及標準曲線的繪制

將濃度為10 mg/L的6-氯煙酸三甲基硅酯用平菇基質空白溶液逐級稀釋，配制成濃度分別為0.002、0.005、0.02、0.05、0.2 mg/L的系列標準工作溶液。在1.2所述色譜條件下進行測定，以其質量濃度和峰面積為橫、縱坐標，繪制標準曲線。

1.6 計算

樣品的檢測對象為6-氯煙酸三甲基硅酯標準溶液濃度，因此樣品中的吡蟲啉殘留量（吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基的代謝物之和）需用稀釋因子折算[13]。按式（1）和（2）分別計算樣品檢測濃度和回收率。

式中：Cs為樣品中吡蟲啉的檢測濃度，mg/kg；m為稱樣量，g；V為定容體積，mL；n為稀釋因子；A為樣品峰面積，mAU·min；b為標準曲線截距；a為標準曲線斜率。

式中：r為回收率；Cs為樣品的檢測濃度，mg/kg；Ct為添加濃度，mg/kg。

2 結果與分析

2.1 最終衍生物質譜結果分析

吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基的代謝物基通過加入N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA），發生硅烷化，轉化為6-氯煙酸三甲基硅酯。利用安捷倫自動優化軟件Optimizer進行二極質譜分析，根據最終優化結果，離子強度最大的112為定量離子，離子強度次之的140、170.1為定性離子[14]。在電子轟擊離子源（EI）檢測模式進行全掃（MS2Scan），選擇質荷和絕對強度較大的離子214為6-氯煙酸三甲基硅酯前體離子，6-氯煙酸三甲基硅酯質譜圖見圖4。

圖4 定量定性離子對的質譜圖

2.2 線性范圍

在0.002～0.2 mg/L范圍內，6-氯煙酸三甲基硅酯的線性方程為y=600 843.555 466x＋409.212 699，R2=0.999 5，R2＞0.999，則工作溶液在0.002～0.2 mg/L范圍內線性關系良好，符合檢測要求[15]，見圖5。

圖5 6-氯煙酸三甲基硅酯的標準曲線圖

吡蟲啉在平菇上的定量限為0.02 mg/kg，符合準則中定量限為0.01～0.05 mg/kg的要求[16]。

2.3 準確度和精密度

目前尚未制定吡蟲啉在平菇中的MRL值，因此吡蟲啉在平菇基質空白樣品中添加濃度設置為0.02、0.05和0.5 mg/kg，符合準則中如果尚未制定MRL值，添加水平應包括定量限和高于10倍定量限的濃度的要求[16]。準確度以平均回收率表示，吡蟲啉加標平均回收率為86%～95%；精密度以相對標準偏差表示，其相對標準偏差為1.7%～4.8%，具體結果見表2。結果表明該方法準確度和精密度良好，穩定可靠。

表2 吡蟲啉加標平均回收率及相對標準偏差（n=5）

3 結 論

本研究創新性地建立了一種柱前衍生法對平菇中吡蟲啉殘留物進行氣相色譜-串聯質譜法測定分析。平菇樣品中的吡蟲啉及其代謝物經乙腈提取，在堿性KMnO4溶液和70℃水浴條件下氧化反應轉化為含6-氯-煙酸吡啶基的代謝物，經甲基叔丁醚萃取濃縮，正己烷復溶，N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（MSTFA）衍生為6-氯煙酸三甲基硅酯。通過最終衍生物質譜分析，并采用GC-MS/MS測定，對吡蟲啉在平菇中的平均回收率為86%～95%，相對標準偏差為1.7%～4.8%。本研究結果表明，該方法操作簡單方便、高效準確，適用于平菇中吡蟲啉及其含6-氯-吡啶基代謝物的殘留總量的檢測。