miR-30a-5p 表達(dá)對結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的影響研究

彭柳花，賈雄，賀德，陳天明

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是臨床消化道常見惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、早期轉(zhuǎn)移侵襲能力較強(qiáng)和患者預(yù)后5 年生存率較低等特點。既往研究數(shù)據(jù)顯示［1］，我國CRC 發(fā)病率約15%，死亡率約10%。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是CRC 腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的始動因素，是導(dǎo)致CRC 患者病情進(jìn)展的重要因素［2］。微小RNA（microRNA，miR）被證實在腫瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮廣泛生物學(xué)功能［3-4］。miR-30a-5p在肺癌、腦膠質(zhì)瘤、腎細(xì)胞癌等惡性腫瘤中表達(dá)降低。而miR-30a-5p 表達(dá)的異常是否與CRC 的病情進(jìn)展有關(guān)，尤其是miR-30a-5p 是否能通過調(diào)控CRC患者EMT 過程從而促進(jìn)病情進(jìn)展仍需進(jìn)一步研究［5］。基于此背景，本研究擬通過離體實驗和在體實驗，以期明確miR-30a-5p 表達(dá)與CRC 病情發(fā)展的關(guān)系及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細(xì)胞系 采用NCM460、HCT116 細(xì)胞系和裸鼠作為研究對象。本研究經(jīng)南方科技大學(xué)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑與儀器 倒置熒光顯微鏡（深圳市眾尋光學(xué)儀器有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（濟(jì)南好來寶醫(yī)療器材有限公司），Chemi Doe XRS+成像儀（上海土森視覺科技有限公司），渦旋振蕩器（河北慧采科技有限公司），流式細(xì)胞儀（南京珺蔚生物科技有限公司），SP 試劑盒（上海研啟生物科技有限公司），H202（夏津尚達(dá)經(jīng)貿(mào)有限公司），檸檬酸鹽緩沖溶液（武漢卡諾斯科技有限公司），DAB 溶液（廣州鼎國生物技術(shù)有限公司），蘇木精碧（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司），Trizol（北京華越洋生物科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），RIPA 裂解液（上海邦景實業(yè)有限公司），胎牛血清（上海滬震實業(yè)），高糖培養(yǎng)基（廣州濟(jì)恒醫(yī)藥科技），雙抗（北京博奧派克生物科技），Lipofectamine 2000（上海北諾生物科技有限公司），MTT細(xì)胞增殖（北京百奧創(chuàng)新科技有限公司），細(xì)胞毒性檢測試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司），Transwell 小室（南京迅貝生物科技有限公司），培養(yǎng)基（山東萍聚生物科技有限公司），雙抗霉素（湖北貓爾沃生物醫(yī)藥有限公司），胰酶（鄭州裕和食品添加劑有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選取NCM460、HCT116 細(xì)胞系作為研究對象。將細(xì)胞置于常規(guī)培養(yǎng)基（DEME 培養(yǎng)基、1640 培養(yǎng)基）中進(jìn)行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中補(bǔ)充10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素和100 mg/L 鏈霉素。當(dāng)細(xì)胞融合度＞80%時進(jìn)行消化、傳代操作，并取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 采用Trizol 法提取上述培養(yǎng)完成細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，隨后嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。反應(yīng)條件：90 ℃預(yù)變性6 min；95 ℃變性15 s，64 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)42 個 循 環(huán)。引 入 序 列：（forward）CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC；（reverse） CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)期的HCT116 細(xì)胞，每組3 個平行樣本，接種至6 孔板（1×105個/ml），并進(jìn)行培養(yǎng)。實驗分組為對照組、miR-30a-5p 模擬物組和miR-30a-5p 抑制劑組。嚴(yán)格按照LipofactamineTM2000 試劑盒說明書轉(zhuǎn)染miR-30a-5p 模擬物、miR-30a-5p 抑制劑，對照組不做任何處理。轉(zhuǎn)染操作完成后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，48 h 后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 miR-30a-5p mRNA 表達(dá)水平檢測 采用同

1.2.2 中的方法及引物設(shè)計，檢測NCM460、HCT116細(xì)胞系中miR-30a-5p mRNA 表達(dá)水平。

1.2.5 HCT116 細(xì)胞Transwell 實驗觀察侵襲能力 取Transwell 杯狀小室，首先將Matrigel 膠進(jìn)行稀釋，稀釋操作完畢均勻涂抹至杯底，于下室滴入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于上室中滴入各組10%細(xì)胞懸液200 μl。培養(yǎng)24 h 直至Matrigel 膠降解。培養(yǎng)完成后將小室取出并進(jìn)行沖洗（PBS）和染色，染色操作完畢采用無菌棉簽將上層細(xì)胞擦去，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)觀察。

1.2.6 HCT116 細(xì)胞劃痕試驗觀察遷移能力 取上述實驗中培育至48 h 的細(xì)胞。重懸后接種至6 孔板，待細(xì)胞融合后將培養(yǎng)基棄去，并采用20 μl 移液器槍頭在培養(yǎng)板底部進(jìn)行劃痕操作，并重新加入培養(yǎng)基后再次培養(yǎng)過夜，次日顯微鏡拍照后計算細(xì)胞遷徙率。

1.2.7 Western blotting 法檢測HCT116 細(xì)胞Ecadherin、Vimentin 表達(dá)量 取上述實驗中培育至48 h 的HCT116 細(xì)胞，提取全蛋白并進(jìn)行定量，定量操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。取適量樣本進(jìn)行凝膠電泳，操作完成后進(jìn)行洗滌，滴入E-cadherin、Vimentin 的一抗（1∶1 500），4 ℃條件下孵育過夜，次日滴入二抗（1∶2 000），再次在室溫下孵育2 h，孵育完成后再次進(jìn)行洗滌。洗滌操作完成后加入發(fā)光液，并進(jìn)行顯影、成像等操作。所有實驗操作均進(jìn)行3 次，取平均值。

1.2.8 裸鼠成瘤實驗 按miR-30a-5p 模擬物、miR-30a-5p 抑制劑、對照組的分組方式進(jìn)行裸鼠成瘤實驗，每組8 只。在實驗前所有裸鼠均于同樣條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，時間1 周。將轉(zhuǎn)染完成細(xì)胞采用1 000 r/min進(jìn)行離心（離心半徑16 cm），時間為5 min，隨后采用PBS 進(jìn)行沖洗，沖洗完畢收集細(xì)胞。采用皮下注射的方式將1×106個轉(zhuǎn)染完成的HCT116 細(xì)胞注射至裸鼠腹腔內(nèi)。隨后每日觀察裸鼠腫瘤的大小，計算生長40 d 后的腫瘤體積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NCM460、HCT116 細(xì)胞系miR-30a-5p mRNA表達(dá)水平比較

在HCT116 細(xì)胞中miR-30a-5p mRNA 表達(dá)量（0.29 ± 0.02）較在NCM466 細(xì)胞中表達(dá)量（0.76 ±0.12）明顯更低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組侵襲能力比較

與對照組比較，miR-30a-5p 模擬物組細(xì)胞侵襲能力明顯更弱，而miR-30a-5p 抑制劑組細(xì)胞侵襲能力明顯更強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組侵襲能力比較（± s，每組n=3）

表1 各組侵襲能力比較（± s，每組n=3）

注：與對照組比較aP＜0.05

組別miR-30a-5p 模擬物組miR-30a-5p 抑制劑組對照組F 值P 值每個視野進(jìn)入細(xì)胞數(shù)量62.57±6.32a 187.67±17.65a 130.57±12.67 21.37＜0.05

2.3 各組遷移能力比較

與對照組比較，miR-30a-5p 模擬物組細(xì)胞遷移能力明顯更弱，而miR-144-3p 抑制劑組細(xì)胞遷移能力明顯更強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組遷移能力比較（± s，每組n=3）

表2 各組遷移能力比較（± s，每組n=3）

注：與對照組比較aP＜0.05

組別miR-30a-5p 模擬物組miR-30a-5p 抑制劑組對照組F 值P 值每個外溢穿膜細(xì)胞數(shù)量45.23±6.70a 93.23±6.70a 75.21±8.33 15.62＜0.05

2.4 各組E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)水平比較

與對照組比較，miR-30a-5p 模擬物組Vimentin明顯更低，E-cadherin 明顯更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；miR-30a-5p 抑制劑組Vimentin 明顯更高，E-cadherin 明顯更低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)水平比較（± s，每組n=3）

表3 各組E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)水平比較（± s，每組n=3）

注：與對照組比較aP＜0.05

組別miR-30a-5p 模擬物組miR-30a-5p 抑制劑組對照組F 值P 值E-cadherin 1.78±0.67a 0.42±0.17a 1.08±0.08 6.17＜0.05 Vimentin 0.54±0.03a 2.03±0.67a 1.06±0.12 5.85＜0.05

2.5 40 d 時裸鼠腫瘤體積比較

與對照組比較，miR-30a-5p 模擬物組腫瘤體積明顯更小，miR-30a-5p 抑制劑組腫瘤體積明顯更大，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 40 d 時裸鼠瘤體體積比較（mm3，± s）

表4 40 d 時裸鼠瘤體體積比較（mm3，± s）

注：與對照組比較aP＜0.05

組別miR-30a-5p 模擬物組miR-30a-5p 抑制劑組對照組F 值P 值腫瘤體積637.57±61.57a 1 489.54±123.54a 987.67±68.78 11.21＜0.05例數(shù)8 8 8

3 討論

CRC 是起源于上皮組織的消化道惡性腫瘤，糖尿病史、家族史、高血壓史、高脂飲食和低纖維飲食是導(dǎo)致CRC 發(fā)生的危險因素［6］。近年來，隨著微創(chuàng)切除術(shù)治療方法的逐年規(guī)范化和術(shù)后聯(lián)合放化療綜合療法的推行，CRC 患者預(yù)后5 年生存率得到顯著提升［7］。然而CRC 具有易侵襲、轉(zhuǎn)移的特征，而起病初期又較隱匿，使得部分患者就診時已錯過手術(shù)治療最佳時期。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響CRC 患者預(yù)后生存期的獨立危險因素，既往研究數(shù)據(jù)顯示［8-10］，15%～25% 患者存在肝轉(zhuǎn)移。故進(jìn)一步探討CRC患者轉(zhuǎn)移的分子病理特征，在早期進(jìn)行篩查并針對高風(fēng)險人群進(jìn)行靶向干預(yù)的意義重大。

miR-30a-5p 是miR-30 家族成員，其定位于人類6 號染色體的q13 位置。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌、喉鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中miR-30a-5p 的表達(dá)下調(diào)［11-12］。邱會等［13］研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p 的表達(dá)對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞的增殖及遷移存在靶向調(diào)控作用。何雨等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p 可通過調(diào)節(jié)胰腺導(dǎo)管腺癌患者成纖維細(xì)胞活化，從而影響腫瘤的增殖、遷移過程。王勇等［11］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者miR-30a-5p 的表達(dá)改變與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲行為密切相關(guān)。此外有研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p 可通過影響腫瘤細(xì)胞的EMT 過程，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移［15-16］。EMT 主要指細(xì)胞外基質(zhì)與腫瘤基底膜被破壞、細(xì)胞間喪失黏附和細(xì)胞極性變化，使腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力被顯著增強(qiáng)［17］。E-cadherin 的表達(dá)降低和Vimentin的表達(dá)顯著上升是反應(yīng)EMT 過程的重要參考［18］。本研究結(jié)果顯示，HCT116 細(xì)胞中miR-30a-5p 的表達(dá)明顯更低，提示miR-30a-5p 的表達(dá)改變可能與CRC 患者基礎(chǔ)病理發(fā)展有關(guān)。為進(jìn)一步驗證miR-30a-5p 在CRC 中發(fā)揮的作用，本研究通過轉(zhuǎn)染miR-30a-5p 模擬物和miR-30a-5p 抑制劑，結(jié)果顯示，miR-30a-5p 模擬物組HCT116 的侵襲和遷移能力明顯低于miR-30a-5p 抑制劑組，表明miR-30a-5p的表達(dá)改變與CRC 侵襲、遷移行為有關(guān)。為進(jìn)一步明確miR-30a-5p 的作用機(jī)制，采用Western bloting法檢測Vimentin 和E-cadherin 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，較miR-30a-5p 抑制劑組，miR-30a-5p 模擬物組Vimentin 明顯更低，而E-cadherin 明顯更高，表明miR-30a-5p 可通過調(diào)控CRC 細(xì)胞的EMT 行為影響病情進(jìn)展。本研究采用裸鼠進(jìn)行在體實驗發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞注射完成40 d 后，miR-30a-5p 抑制劑組腫瘤體積顯著高于miR-30a-5p 模擬物組，證實miR-30a-5p的表達(dá)改變與CRC 的發(fā)生密切相關(guān)，亦明確臨床可通過監(jiān)測結(jié)直腸癌患者miR-30a-5p 的表達(dá)情況，對其病情發(fā)展作出預(yù)測并為臨床的早期靶向干預(yù)提供新線索［19］。

綜上所述，miR-30a-5p 可通過調(diào)控CRC 患者EMT 過程，從而影響腫瘤病情的發(fā)生、發(fā)展。然而本研究尚存不足，未納入臨床CRC 前瞻性隊列作為研究對象，故在今后研究中仍需進(jìn)一步開展實驗予以論證。