金黃色葡萄球菌表面蛋白及致病性相關研究進展

王曉寧，景雙艷

（甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000）

1 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）在我們生活中無處不在，它可以引起食物中毒、機體的局部皮膚感染，嚴重時會導致肺炎、敗血癥甚至死亡。

1.1 金黃色葡萄球菌的生物學特征

金黃色葡萄球菌是一個在顯微鏡下觀察呈葡萄串狀、球型的革蘭陽性菌，無鞭毛，無芽胞，大多數無莢膜。

對于生長條件，金黃色葡萄球菌的營養要求不高，需氧或兼性厭氧，在普通的MH（Mueller-Hinton agar plate）平板上就能生長，最適溫度是37℃，最適PH為7.4，科研實驗中一般將其在血平板和胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(Tryptic Soy Agar,TSA培養基)平板上進行培養，在以上平板上的金黃色葡萄球菌菌落形狀呈圓形凸起，表面光澤，在血平板上會出現完全透明的β溶血環，這也是鑒定金黃色葡萄球菌的標志之一。液體培養基的選擇一般肉湯（LB）培養基和胰酪大豆胨液體（TSB）培養基，37℃過夜培養后，發現金黃色葡萄球菌呈均勻混濁生長。

金黃色葡萄球菌的生化反應中[1]：觸酶（+）、葡萄糖（+）、麥芽糖（+）、蔗糖（+）、7.5%NaCl甘露醇（+）、棉子糖（-）、水楊苷（-）、明膠（+）、血漿凝固酶（+）、DNA酶（+）、七葉苷（-）、A蛋白和凝集因子（+）。

1.2 金黃色葡萄球菌的流行病學

金黃色葡萄球菌是一種人獸共患病原菌，它存在自然界各個地方，比如土壤、空氣和水中；在人的皮膚、鼻咽部等也會發現金黃色葡萄球菌的存在。據文獻查閱，健康人攜帶金黃色葡萄球菌的比率為20%-30%，上呼吸道感染患者的鼻腔中檢測發現帶菌率高達83%，化膿性感染患者的感染部位也有發現金黃色葡萄球菌的存在。在美國的疾病控制中心報道，由金黃色葡萄球菌引發的感染僅次于大腸桿菌，占第二位[2]；在我國由金黃色葡萄球菌引發的食物中毒事件占25%左右，位居第四位[3]。

由于金黃色葡萄球菌自身的一些特征從而形成了如下幾個流行病學特點：第一，季節分布，在春夏季節， 由于氣候呈現溫熱潮濕，在這種條件下，更加利于金黃色葡萄球菌的生長繁殖，導致春夏季節成為金黃色葡萄球菌感染的高發時間。第二，引發食物中毒，由于金黃色葡萄球菌存在自然界的各個角落，就連食物表面也不例外，比如奶、肉、蛋、魚及其制品，這些食物被金黃色葡萄球菌感染后，如果沒有進行滅菌處理則會導致細菌性食物中毒，嚴重者會引起機體紊亂，甚至引起死亡。第三，人獸共患，在上呼吸道感染患者的鼻腔中也發現金黃色葡萄球菌的存在，這應引起我們的高度重視。

近年來，隨著大量抗生素應用于臨床治療，金黃色葡萄球菌出現了大量的耐藥菌株，其中最為嚴重的是甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA），MRSA又分為醫院獲得性MRSA（HA-MRSA）和社區獲得性MRSA（CA-MRSA），兩者的區別是患者是否在門診或入院48h之內分離得到的MRSA菌株。CAMRSA通常只對β-內酰胺類抗生素耐藥，但HA-MRSA可對多種藥物耐藥。

2 金黃色葡萄球菌的耐藥機制

目前對于β-內酰胺類抗生素耐藥的耐藥性機制主要分為兩種：一種是產生β-內酰胺酶，它可以在抗生素作用之前使β-內酰胺抗生素失活或降解。另一種是青霉素結合蛋白2a（PBP2a）的產生，該蛋白與β-內酰胺類抗生素的親和力低，從而繞開了抗生素的活性[4]。CA-MRSA耐藥機制主要是由于青霉素結合蛋白(PBPs) 發生變化所致，它產生的PBP2a可以導致與β-內酰胺類抗生素（所有頭孢菌素和半合成青霉素）的親和力下降。因此PBPs會受到抑制而不能發揮作用，但PBP2a仍能夠發揮PBPs所有的功能，并參與細菌細胞壁的合成，使細菌得以生存，從而表現為對β-內酰胺類抗生素耐藥[5]。PBP2a由mecA基因編碼，而MRSA的種屬可以根據mecA基因類型分類[6]。

3 金黃色葡萄球菌的表面蛋白

當前金黃色葡萄球菌需要找到新的抗生素，需要尋找到對于細菌新的靶點，金黃色葡萄球菌表面蛋白正因為與宿主有著特異性粘附能力，成為對抗金黃色葡萄球菌感染疫苗開發的新熱點。目前金黃色葡萄球菌表面蛋白主要為細胞外結合基質蛋白（extracellularmatrix-binding proteins,ECMBP），細胞外基質（extracellular-matrix，ECM）在脊椎動物的組織和器官中都會發現，通過大量實驗研究發現，它可以支持、增殖及調節基因表達[7]。它們與細胞相互作用，又參與生理和病理的過程，例如幫助機體傷口的愈合以及癌細胞的轉移。細胞表面也存在大量的ECM受體，它們被稱為整合素（integrins）家族[8-9]，病原性細菌表面的ECM受體被稱為黏附素或者是可以識別粘附基質的細胞表面成分（Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecule, MSCRAMM），它們被認為是細菌感染的必要條件之一[10-11]，因為如果沒有這些成分，細菌無法定植及繁殖，更不能釋放外毒素（exotoxin），就不會引起感染。不僅如此，當細菌完全被機體ECM 所包被后，機體的免疫系統不會將其識別，從而進一步引發感染。

目前金黃色葡萄球菌中有5個表面蛋白的分子結構已研究清楚（圖1），分別是葡萄球菌蛋白A（SpA）、膠原蛋白結合（Cna）蛋白、纖連蛋白結合（FnBP）蛋白、纖維蛋白結合（ClfA）蛋白和彈性蛋白結合蛋白（Ebps）。其中SpA不屬于MSCRAMM，它可以結合IgG的Fc區域來抑制吞噬作用[12]，它還可以介導血管假性血友病因子（von Willebrand）與金黃色葡萄球菌結合。

圖1 MSCRAMM蛋白的結構[13]

3.1 識別纖連蛋白的FnBP

細菌中的FnBP蛋白可以分為FnBPA和FnBPB，它的相對分子質量約為110 000，它的結構由七部分組成，分別是處于N端的信號肽（S）區，之后為非重復序列的伸展區（A），接下來是含有2個重復單元的（B）區域，C區之后有4個重復的D區，它們是由38個氨基酸殘基模塊構成的結構域，緊接著是細胞壁延展區域（W），最后是相對保守的LPXTG基序。

3.2 識別膠原蛋白的Can

細菌中的Can蛋白使細菌粘附至膠原蛋白、組織及軟骨上。它的結構由五部分組成，分別是信號肽（S）區，緊跟著分子質量為55 000的A區，之后為3個重復序列的B區，接下來是細胞壁延展區域（D）和LPXTG基序。其中B區經研究發現，這段重復序列對于Can蛋白為非必需的。在A子區域發現兩個反向平行的β折疊以及兩個α螺旋結構，它們共同組成“果凍狀”折疊結構，此區域可以抑制細菌與膠原蛋白結合[14-15]。

3.3 識別纖維蛋白原的ClfA

細菌中的ClfA蛋白決定著金黃色葡萄球菌與含纖維蛋白基質作用[16]，ClfA蛋白出現在細菌生長的每一個階段，它與其它表面蛋白結構不同之處在于，含有一個獨特打R區域，這個區域由Asp-Ser的二肽重復組成，前后分別是A區和細胞壁延展W區，此區域可以促使A區在細菌表面與配基發生作用[17]。

4 金黃色葡萄球菌表面蛋白Ebh

金黃色葡萄球菌表面蛋白具有很多功能，它可以使細菌粘附和定植，進一步形成生物被膜，一方面可以躲開免疫系統和免疫細胞的“追殺”，另一方面又阻礙了抗生素的殺菌作用[18]。最終導致機體免疫能力下降，發生感染從而致病。Kuroda等利用生物信息學技術在金黃色葡萄球菌細胞表面發現了一種新的蛋白—Ebh蛋白，這是一種功能未知的細胞外基質結合蛋白，定位于C末端[19]。有研究發現，在已確診的金黃色葡萄球菌感染的患者血清中出現了抗Ebh抗體，定位研究顯示Ebh蛋白與細胞包膜有關[20]。深入研究Ebh蛋白對金黃色葡萄球菌生物被膜形成及耐藥機制有重大的意義。

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4.1 Ebh蛋白的特性

Ebh蛋白是在金黃色葡萄球菌中發現的一個巨蛋白，約1.1-MDa蛋白，與其他ECMbinding protein具有同源性。它擁有幾個結構域，包括一個由126個氨基酸組成的52個不完全重復序列的大中心區域。通過電子顯微鏡直接觀察包含大量重復單元的Ebh蛋白結構，發現Ebh是由高度柔韌的絲狀分子組成的；它有高度重復的結構和獨特的結構靈活性，即與細胞壁的糖結合，這種結合導致細胞內壁相互交錯，緊密聯系在一起，使得細胞變得更加堅固[21]，同時也避免了在高滲條件下發生質壁分離，促進結構內穩態。Ebh蛋白的結構分析還顯示它是一個320nm棒狀分子，在模塊連接處具有高塑性[22]。

前期課題組首次從醫院臨床分離的48株金黃色葡萄球菌中發現19株Ebh基因陽性菌株，通過mecA基因檢測，鑒定19株Ebh基因陽性菌株中11株為MRSA，8株為MSSA，兩者中Ebh基因的攜帶率差異無統計學意義。利用脈沖凝膠電泳(PFGE，Pulsed Field Gel Electrophoresis)對Ebh基因陽性菌株進行分型，結果顯示菌株主要為A型流行株，并對菌株標本來源進行統計，發現大多數Ebh基因陽性菌株來自燒傷病區患者，我們進一步推測Ebh基因可能與其黏附宿主細胞外基質有關[23]。

4.2 Ebh蛋白的致病性研究

4.2.1 金黃色葡萄球菌ArlRS通路調控Ebh基因的表達

金黃色葡萄球菌是非常普遍的一種細菌病原體，引起人類很多嚴重的疾病。抗生素的頻繁使用導致這些疾病更加難以治療，因此人們開始尋找新的治療工具。有研究表明，金黃色葡萄球菌在凝集過程中可以結合人基質蛋白形成穩定的團塊，這些團塊有助于逃避宿主防御并建立感染，他們通過不同的技術來研究金黃色葡萄球菌的凝集機制，最后發現ArlRS雙組分調節系統通過調節編碼巨型葡萄球菌表面蛋白（GSSP）的Ebh基因的表達來控制凝集；這也在敗血癥和感染性心內膜炎的兔模型中得到證實，證明ArlRS是毒力的重要調節劑[20]。Fournier和Hooper最初確定并將ArlRS定性為自溶調節因子。然而，Memmi等人進一步研究發現ArlRS在自溶中的調節作用僅限于對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（MSSA）菌株，MRSA中的自溶作用受一種獨特但尚未確定的機制控制。研究過程中發現Ebh基因參與凝集過程，Ebh基因大小約為33kbp，是金黃色葡萄球菌染色體上最大的開放閱讀框，有效地包含了其基因組[24]的1%；Ebh基因編碼的Ebh蛋白，也稱為GSSP，預計是膜錨定的并以纖維狀方式從細胞表面突出[25]。為了進一步研究ArlRS雙組分調節系統如何影響細菌凝集，分別在USA300（LAC-WT）菌株中構建了arlRS基因敲除菌株（LAC △arlRS）、arlRS基因及Ebh基因雙基因敲除菌株（LAC △arlRS △Ebh），并通過實時熒光定量PCR （qPCR）來檢測基因的表達變化情況。研究結果發現，當ArlRS基因敲除后，Ebh基因表達上調近50倍；又通過凝集實驗發現，LAC△arlRS不能發生凝集反應，而LAC △arlRS △Ebh能夠發生凝集；最后通過光學顯微鏡觀察三種細菌（LAC-WT、LAC △arlRS和LAC △arlRS △Ebh）的形態學結構是否有所差異，結果顯示三者都會形成緊密簇，但觀察LAC△arlRS菌株發現其細胞分布比較松散，進一步證實了Ebh基因影響了細菌凝集，如何影響凝集的過程還需要進一步的研究。

4.2.2 Ebh蛋白在穩定SCV細胞中的表達

金黃色葡萄球菌發病機制的一個未確定的特征是其持續存在然后疾病復發。這可以通過改用其他生活方式來解釋，主要是生物被膜或小菌落變種（SCVs）[26]。金黃色葡萄球菌SCV現已明顯與不同的疾病相關，重要的是這些疾病包括慢性感染，如囊性纖維化，慢性鼻竇炎，心內膜炎和慢性骨髓炎患者[27-29]。SCV被定義為產生直徑≥1mm的菌落的變體，具有降低的色素沉著和溶血活性[30]。研究發現當金黃色葡萄球菌轉化為SCV的時候，會形成一種細胞外基質，它是由蛋白質和DNA組成的，通過qPCR來檢測相關基因的表達變化，結果發現Ebh基因發生顯著上調，并推測它參與了金黃色葡萄球菌的致病過程[31]，另外，由于此基因編碼的蛋白過于巨大，推測Ebh蛋白可能會通過干擾肽聚糖的生物合成進一步影響細胞壁的合成[25]。最后，他們從分批培養的細胞和恒化器衍生的穩定SCV細胞制備膜蛋白組分，并對這些細胞進行分析和比較，在這種膜蛋白質組學中，與批量生長細胞相比，Ebh蛋白顯示穩定SCV幾乎增加了5倍，其他膜蛋白的表達也發生變化，這些蛋白也可能形成穩定的SCV基質的一部分。

5 金黃色葡萄球菌與生物被膜的關系

5.1 生物被膜形成過程

MRSA形成生物被膜的過程（圖2）十分復雜，主要分為以下幾個部分：①細菌粘附在機體表面；②細菌聚集與增殖；③形成生物被膜；④細菌脫落并轉移。當生物被膜內環境不能滿足細菌的時候，會通過分泌胞外水解酶，使胞外多糖發生分解，從而成為浮游菌，然后繼續粘附、聚集、增殖、形成新的生物被膜，就這樣周而復始，生物被膜變得更加堅固。成熟的生物被膜內部會形成一個液體充足的通道，內部的細菌可以經過通道來傳遞營養物質。在分子學角度上，參與生物被膜形成的分子包括①自溶素A：促使細菌粘附至宿主細胞表面；②多糖胞間黏附素（Polysaccharide Intercellular Adhesion,PIA）：可以促進生物被膜成熟，由ica基因編碼合成，但ica基因并不是形成生物被膜的必需基因，大量實驗研究發現，一些細胞外基質蛋白比如Bap、Embp、FnbpA、FnbpB等，都能夠使細菌通過ica非依賴途徑形成生物被膜[32]；③細胞外DNA（Extracellular DNA,eDNA）：eDNA由細菌通過水解胞外多糖產生，它可以促使其它金黃色葡萄球菌進行聚集，從而形成生物被膜。大量實驗數據表明金黃色葡萄球菌生物被膜形成還與培養細菌的營養條件、溫度和時間有密切聯系。

圖2 細菌生物被膜形成過程[33]

5.2 群體感應系統對生物被膜形成的影響

5.3 生物被膜的致病性與耐藥性及其機制

生物被膜形成之后，機體并不會發生嚴重的炎癥反應，這是因為生物被膜阻礙了細菌與定植部位的接觸，這使得細菌與機體發生共存；另一方面，這也阻斷了抗生素和機體防御系統對細菌的殺傷，生物被膜內細菌還可以通過脫落繼續形成新的生物被膜，導致機體不斷發生感染。它的致病機制主要分為2個方面：①生物被膜為細菌定植及感染提供了屏障：生物被膜阻擋了抗體及炎性細胞進入膜內，從而使得無法清除細菌；②損傷免疫細胞：中性粒細胞由于無法進去細胞被膜內部只能聚集在其周圍，細胞被膜又阻礙了機體特定信號的傳遞，最終導致這些中性粒細胞釋放細胞毒素、蛋白酶等，使周圍組織發生損傷[34]。

6 展望

金黃色葡萄球菌是一種革蘭陽性病原體，是醫院和社區獲得性感染的主要原因，包括致病疾病，如菌血癥、感染性心內膜炎和敗血癥[35]。在金黃色葡萄球菌感染個體的血清樣本中檢測到抗ebh免疫球蛋白G，表明Ebh蛋白在感染過程中表達。此外，最近的研究已經在篩選人類感染期間在體內表達的基因中鑒定出了這種蛋白[36]。以綠色熒光蛋白為報告源，將Ebh蛋白定位于整個細胞表面，這表明，Ebh蛋白可能通過在細胞壁、細胞壁和細胞質膜之間形成橋梁，以避免在高滲條件下發生質分裂，從而促進結構內穩態[24]。通過電子顯微鏡觀察到很多扭曲的桿狀分子，這些分子都具有相同的序列，但分子的形狀卻不相同，這表明結構域存在廣泛的靈活性[21]。金黃色葡萄球菌為什么會產生像Ebh蛋白這樣大的蛋白質還不清楚。鑒于Ebh蛋白的巨大規模，人們很容易推測出它可以形成一種細胞粘附的特殊表面結構[24]。

細菌細胞的表面顯示出與肽聚糖共價錨定的多種蛋白質，它們具有許多功能，包括與宿主細胞和組織的粘附，非吞噬細胞的侵入，以及先天免疫反應的逃避。基于結構和功能分析，蛋白質已被分類為不同的類別。許多表面蛋白是多功能的，細胞壁錨定的蛋白質在共生狀態期間和侵入性感染期間執行支持存活和增殖的基本功能；細胞壁錨定蛋白結合脫皮上皮細胞的能力在定植期間是重要的，并且與纖維蛋白原的結合在發病機理中具有特別重要[37]。

現在仍然有很多金黃色葡萄球菌表面蛋白的功能尚未發現，需要我們去發掘及深度研究，為解決細菌耐藥性提供新的靶點，更好應用于臨床治療。對于表面蛋白的研究不能僅僅針對于其結構，可以在分子水平上進行研究。目前隨著科學技術的飛速發展，越來越多的新技術應用于科研之路上，其中包括對細菌進行全基因組測序、基因敲除、轉錄組測序、蛋白組學測序等?；蚪M測序主要分為一代測序、二代測序和三代測序；基因敲除主要針對某個基因功能的研究；轉錄組測序主要針對細胞轉錄后的RNA進行分析研究；蛋白組測序則是針對轉錄翻譯后的蛋白質進行機制及通路方面的研究。這些技術將為我們研究新的表面蛋白奠定基礎。