Galectin-3 誘導CCL3表達促進椎間盤軟骨終板退變的分子機制研究

劉巖路，胡煒，汪夢琪，黃異飛

（新疆醫科大學第四附屬醫院脊柱二科，新疆 烏魯木齊 830000）

0 引言

腰痛（LBP）是一種與脊柱的肌肉及骨骼相關的最常見的疾病。它最主要的表現為肋緣以及臀下皺襞之間產生的疼痛，包括僵硬與肌肉緊張，甚至會影響膝關節以下，小腿的周圍的神經根甚至小腿疼痛[1]。全世界的LBP發生比例約為85%，在任意給定時間，任意年齡段的LBP的發生率約為18%[1]。除此之外，每個人在一生當中，經歷LBP的可能性約為80%[2]。目前，腰背痛（LBP）已經成為一種全球性質的與醫療保健相關的問題，比任何其他疾病都更能引起全球性的殘疾[3]。嚴重的影響了患者的心理健康、生活質量以及經濟負擔。伴隨著全球人口的老齡化，與LBP疾病相關的多種負擔會以指數級增加[4-5]。在臨床診療中，LBP可能引起多種疾病的相關癥狀，而腰椎間盤的退變是導致LBP產生的最主要因素[6]。單從形態學上來說，腰椎間盤內并無血管走行，而椎間盤內的營養的供應及代謝物質的運輸最主要是依靠軟骨終板來完成的[7]。只要腰椎間盤出現了退變的現象，就會進一步導致椎間盤軟骨終板出現撕裂、硬化，從而進一步導致椎管狹窄、椎間隙變窄等一系列臨床問題，最后導致腰椎間盤的形狀、穩定性及功能的缺失，使得LBP發生與惡化[8-10]。

Galectin-3是一種質量大小為29至35kDa之間的蛋白質，屬于β-半乳糖苷結合類動物凝集素家族，在多種組織中都有表達。近年發現[11]，半乳糖凝集素 Galectin-3可被作為細胞標記物和促生存因子，細胞及軟骨細胞之間相互作用的調節類因子，是一種靶蛋白與MMPs活性的調節類因子。預測 Galectin-3 可通過調節細胞外基質降解及炎性細胞浸潤從而在脊柱退變中發揮作用。為此項目組在前期工作基礎上，擬進一步以軟骨終板退變為切入點，系統研究和確立半乳糖凝集素 Galectin-3 通過激活 MMPs、Aggrecan等蛋白降解酶正調節CCL3 在軟骨終板中的表達,進而促進了巨噬細胞遷移并進一步闡明調節 CCL3 表達的分子作用機制，從全新的方面來闡述了椎間盤軟骨終板退變可能的作用及相關機制。借此為建立通過干預 Galectin-3延緩脊柱退變的治療策略提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞：大鼠椎間盤軟骨終板細胞和大鼠椎間盤軟骨終板細胞培養基，Procell，中國；MTT試劑盒，BIOFROX，中國；Fetal Bovine Serum，Penicillin-Streptomycin，Trypsin-EDTA (0.25%)， phenol red，GIBCO，美國；TIANScript RT Kit，SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen），天根，中國；BCA蛋白濃度測定試劑盒，Solarbio，中國；CCL3 Rabbit pAb(A7568)， Abclonal，中國；Anti-MMP3抗體[EP1186Y]， Abcam， 美國；Aggrecan Polyclonal Antibody，Proteintech，中國。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞復蘇與傳代

將大鼠椎間盤軟骨終板細胞從低溫液氮里取出，然后快速放入37℃的水浴鍋當中，然后輕輕搖動凍存管，使得凍存液溶解；待溶解以后將細胞轉移到另含有5mL培養基的離心管之中，離心法收集細胞，使用含有10%胎牛血清的完全培養基來懸浮細胞，然后接種到培養皿中，并且輕輕吹打來混勻，在37℃ 5%CO2的飽和濕度條件下來培養。間隔每2天都更換培養液一次。待細胞融合到80%左右，用0.25%胰蛋白酶-EDTA來收集細胞，按照1:3來傳代，最后取 P2 代的細胞來進行實驗。

1.2.2 細胞存活率分析

取正處于對數生長期，且生長狀態相對良好的大鼠椎間盤軟骨終板細胞，以5×103個/孔，接入96孔板，同時設空白組對照，使用37℃培養條件過夜（并且在所有細胞孔周圍孔內加入100μL無菌PBS），然后按以下分組條件對細胞來進行處理：對照組和Galectin-3抑制劑組（GB1107 25uM），處理的時間分別為12h、24h、48h。在指定時間之內，每個孔都加入10μLMTT，37℃溫度條件下培養4h；而后吸出培養基組織，加入150μLDMSO震蕩10min，使用酶標儀測定各個孔的吸光值OD 568。 所有的實驗重復三次。

1.2.3 RT-qPCR

通過DNAMAN軟件設計MMP3、Aggrecan、CCL3熒光實時定量PCR引物，由上海生工有限公司生產合成。分別加入2μL5×PrimeScript Buffer，0.5μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligo（dT）15 (15μM)，0.5 μLRandom 6 mers (100μM)，Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O達到10μL，混勻后短暫離心，放于PCR儀上37℃溫度條件下溫浴15min，85 ℃溫度條件下加熱5s，稀釋至35μL，即得到反轉錄的cDNA。qPCR反應：Forward primer 10 μM 0.8μL，0.8 μLReverse primer 10μM，2XSYBR Select Master Mix (2×) 10μL，RNase-free water 6.4 μL，cDNA template 2μL，配制成20μL體系且混合均勻，放在儀器上持續保持95℃，1 min，95℃，10s，60℃ 34s，做40個循環，94℃ 1min 30s，60℃ 1min，60℃→94℃，1.1℃/s升溫，從而最終獲得qPCR反應的結果，使用2-ΔΔCt方法用于結果量化計算。

1.2.4 Western-Blot

將PBS洗凈細胞中加入120μL含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，在4℃溫度條件下12000rpm轉速離心5min后，取適量稀釋的上清溶液，使用 BCA測定法來測定蛋白的濃度，在調整蛋白質濃度之后，使用免疫印跡法( Western blot) 檢測細胞內MMP3、Aggrecan、CCL3的表達，步驟大致如下：經過灌膠、加樣、電泳、轉膜之后，將膜裝入含量5% 的牛血清白蛋白(BSA)封閉液當中，放置室溫搖床中1h，并加入5mL（1:1000）一抗稀釋液在4℃冰箱中過夜。然后加入10mL(1:50000 )二抗稀釋液并置于搖床上2h后，顯色，在暗室里壓片至曝光顯影，結果使用 Quantity-one圖像軟件分析后并進行光密度值掃描計算，分別來計算目的蛋白條帶及GAPDH強度的比值關系( % ) 。

1.3 統計學方法

2 實驗結果

2.1 MTT的檢測結果

使用MTT檢測方法，Galectin-3抑制劑組（GB1107 25uM）在不同的時間段內進行的細胞活性檢測，實驗結果最終如圖1所示。在Galectin-3抑制劑GB1107干預條件下，大鼠椎間盤軟骨終板細胞在12h的時間開始，細胞活性開始逐漸降低，隨著時間的不斷推移，細胞的活性不斷的在下降。在24h抑制劑作用下，抑制細胞的活性率最終可達69%，在48h時，細胞活性持續降低，最終達到54%。3個時間段內細胞活性都與對照組差異有統計學意義，P<0.05。因此，這些數據可以證明細胞的增殖的能力與Galectin-3抑制劑作用時間成負相關。

圖1 各時間點和對大鼠軟骨終板細胞活性的影響

2.2 兩組中MMP3、Aggrecan、CCL3的基因表達情況

采用實時熒光定量PCR法來定量檢測兩組大鼠軟骨終板細胞當中MMP3、Aggrecan、CCL3的mRNA表達情況，具體見圖2。在加入Galectin-3抑制劑GB1107 25uM組的大鼠軟骨終板細胞中MMP3、Aggrecan、CCL3 mRNA表達量較于對照組顯著降低，P<0.05。

圖2 兩組中MMP3、Aggrecan、CCL3的基因表達情況

2.3 兩組中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表達差異

采用Western blot法檢測兩組大鼠軟骨終板細胞中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表達差異性，具體見圖3。在加入Galectin-3抑制劑GB1107 25uM組的大鼠軟骨終板細胞中MMP3、Aggrecan、CCL3 蛋白表達量較于對照組顯著降低，P<0.05。

圖3 兩組中MMP3、Aggrecan、CCL3的蛋白表達差異

3 討論

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IVDD）是一類椎間盤自然產生退化的生理病理的自然過程。自上世紀初，通過對椎間盤退變的不斷研究，發現其致病主要因素包括：應力的損傷、炎癥反應、衰老、感染、營養過程的障礙、遺傳以及腫瘤等，這些因素會導致IVDD的發生和惡化[12-13]。軟骨終板成分是椎間盤的非常重要組成部分，它在維持脊柱椎體的正常形態，保護椎體承受各種壓力，并且吸收靜態的壓力等方面起到積極的作用，同時終板組織又是椎體當中滲透轉運能力的最主要的承擔者，是椎體骨組織中主要營養的供應通路[14]。終板的退變老化與IVDD的產生有著十分密切的聯系。但至今其中的確切機制仍不清楚。

本次研究首次通過研究Galectin-3與MMP3、Aggrecan、CCL3在椎間盤軟骨終板內的相互關系，闡明軟骨終板退變的可能作用機制。椎體終板組織主要是由軟骨細胞和細胞外的基質組織（extracellular matrix，ECM）組成。基質金屬蛋白酶家族（MMPs）是一種能夠降解 ECM 的降解酶。已有研究表明[15]，當軟骨終板受損時，會使基質金屬蛋白酶表達增加，抑制物表達降低，加劇ECM的降解，誘導軟骨終板的破壞，導致軟骨終板退變。MMP3在軟骨破損中起到級聯放大反應，降解蛋白多糖，在軟骨終板中起到至關重要的作用[16]。李龍滕[17]通過研究發現，患者關節軟骨體外培養液當中MMP3的表達量顯著增高，表明MMP3可能是導致關節軟骨細胞退化的最重要細胞因子之一。朱新輝等[18]也通過研究發現，MMP3水平與膝關節骨關節炎病變嚴重的程度(Kellgren-Lawrence分級)呈現正相關。

聚集蛋白聚糖（Aggrecan）是椎間盤里蛋白聚糖當中最主要的一種，在椎間盤內起到滲透和抗機械壓載荷的作用[19]。Aggrecan對軟骨基質的降解起到非常重要的作用[19]。當軟骨終板受損，會導致蛋白聚糖的丟失而脫水，最終導致軟骨細胞基質的降解，然后誘導軟骨終板的退變，同時隨著重復的損傷而進一步增強[20-21]。溫俊等[22]人通過對大鼠的Aggrecan基因過表達實驗發現，過表達Aggrecan可以降低基質的降解，緩解關節軟骨的退變。

CCL3又被稱做巨噬細胞炎性蛋白，其具有募集巨噬細胞的重要功能。而且在炎癥反應以及免疫應答中都發揮著重要的作用[23]。CCL3的表達會促進巨噬細胞發生遷移。有研究證明[24]，CCL3的表達的水平與椎間盤退變的程度呈正相關性，表明 CCL3 可能具有促進椎間盤退變的作用。

本次研究發現，在Galectin-3抑制劑組當中，細胞活性顯著降低，MMP3、Aggrecan、CCL3的基因和蛋白表達量明顯減少，表明Galectin-3與細胞活性、MMP3、Aggrecan、CCL3之間成正相關。我們推測抑制Galectin-3的表達，可以降低MMP3、Aggrecan對細胞外基質的降解，減少CCL3對巨噬細胞遷移的作用，進而抑制軟骨終板的退變。在全新方面闡述了軟骨終板退變可能出現的作用機制，這為椎間盤退變的診斷提供了更多更新的思路與方向，在臨床上可用于其表達水平來判斷治療，為預防和治療椎間盤軟骨終板退變及相關的疾病研究提供新的理論與實驗基礎。