大烏泡抗炎藥效部位的篩選及其有效成分含量測定的研究

唐念，王群*，張美麗，王嬌嬌，李雯君，湯瑾，金陽

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550001）

0 引言

大烏泡為薔薇科懸鉤子屬（Rubus multibracteatus Levl.&Vant.），以根及全株入藥，味微苦，性涼，入肝、脾二經，主產于貴州、云南、四川等地，為我省苗族常用藥，具有祛風除濕、清熱解毒、接骨、涼血、止血的功效，常被當地苗族用于感冒、發熱、腸炎、痢疾、鼻出血等疾病的治療[1]。以大烏泡為主藥的齲齒寧含片，具有治療牙周炎，牙齦炎，齲齒痛療效[2]。大烏泡治療不同病癥時使用的藥用部位有所不同，例如用大烏泡治療痢疾、倒經常用大烏泡的根和莖入藥，清熱解毒時常用大烏泡葉入藥[3,4]。因此，有必要對大烏泡進行藥效部位的篩選。文獻報道[5]，槲皮素和山奈酚可能為大烏泡抗炎鎮痛的藥效物質。蘆丁屬于黃酮類化合物，具有抗自由基活性[6-9]，抗脂質過氧化作用[10,11]。因此，測定這三種活性成分含量對大烏泡的質量控制具有重要意義。鑒于此，本研究對大烏泡抗炎藥效部位進行篩選，并采用HPLC、UV法對大烏泡藥效部位中山奈酚、槲皮素及蘆丁等成分進行含量測定。

1 材料

1.1 儀器

電熱鼓風干燥器（201-2AB，天津市泰斯特儀器有限公司），水浴恒溫振蕩器（THZ-82，常州市中貝儀器有限公司），數據恒溫水浴鍋（DRHH-S4，上海市雙捷實驗設備有限公司），高效液相色譜儀（lc-2040C3D，島津中國有限公司），紫外可見分光光度計（UV-5900，島津中國有限公司），電子分析天平（JA2003，上海舜宇恒平科學儀器有限公司），羅氏全自動生化分析儀（cobacc501，Roche）。

1.2 試藥

蘆丁（100080-202012，中國食品藥品檢定院，純度>98%），槲皮素（100081-201010，中國食品藥品檢定院，純度>98%），山奈酚（110861-202013，中國食品藥品檢定院，純度>98%），吲哚美辛（H12035637，河北山姆士藥業有限公司）乙腈，甲醇（色譜級），其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物

昆明種雄性小鼠（18.39±2.82）g，購自貴州醫科大學實驗動物所，飼養于通風良好，室溫18℃～25℃，按常規定期消的動物房，按每籠8只分裝。由專人飼養管理。小鼠人性化飼養，自由飲水及飼料。動物實驗經貴州中醫藥大學實驗動物倫理委員會許可，實驗操作和處理嚴格遵循國際準則。

1.4 大烏泡不同部位提取物的制備

取1 kg大烏泡用10倍量70%乙醇回流提取3次，每次為3 h，3 h，2 h，合并濾液，回收乙醇至無味，濃縮至1 g/mL，即得大烏泡乙醇提取物。取適量乙醇提取物，依次用4倍量的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次，收集萃取液，回收溶劑，制備干浸膏，即得大烏泡石油醚，乙酸乙酯，正丁醇提取部位。

2 實驗方法

2.1 有效部位的篩選

2.1.1 分組與給藥

分別將小鼠隨機分為6組，每組8只。大烏泡服用量為30g/天[3]，根據人服用劑量換算小鼠劑量，大烏泡70%乙醇提組（780 mg/kg）、石油醚組(90.17 mg/kg)、乙酸乙酯組(144.30 mg/kg )、正丁醇組(267.54 mg/kg)為給藥組，吲哚美辛為陽性藥對照組（6.5 mg /kg），正常小鼠為空白對照組。各組均連續給藥7天，空白對照組給予同體積蒸餾水。

2.1.2 樣本收集

各組小鼠末次給藥后l h于小鼠右耳前后兩面涂抹二甲苯，致耳腫脹后，取血，采用酶聯免疫法（ELISA）檢測小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、TGF-β水平。取血后處死，剪下雙耳，用直徑9 mm自動打孔器，在兩耳廓中間部位同一位置打下耳片，稱重。

小鼠耳腫脹度計算：腫脹度=右耳重-左耳重

2.1.3 數據統計分析

2.2 HPLC測定大烏泡中槲皮素、山奈酚的含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱為ACE Excel 5 C18-AR（250×4.6 mm，5μm）；流動相以0.3%磷酸-甲醇（30:70）等度洗脫，檢測的波長為360nm，柱溫為30℃；流速為0.8mL/min；進樣體積為10μL。

2.2.2 對照品與樣品溶液的制備

分別精密稱取槲皮素對照品1.85 mg、山奈酚對照品1.25 mg，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，制成槲皮素濃度為0.185 mg/mL；山奈酚濃度為0.125 mg/mL的對照品溶液。取大烏泡乙酸乙酯，正丁醇部位干浸膏混合均勻，得有效成分提取物，精密稱取此提取物1 g，轉移至50 mL錐形瓶中，加入鹽酸甲醇溶液（含10%鹽酸）25mL，稱定重量，冷浸30min后，超聲提取60 min（80HZ，60℃），取提取液放至室溫，補量，過濾，即得大烏泡提取物樣品溶液。

2.2.3 線性關系的考察

吸取不同濃度的槲皮素（4.60、9.25、18.50、37.00、74.00、111.00μg/mL）和山奈酚（1.25、6.25、12.50、25.00、75.00、125.00μg/mL）對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。將測得的峰面積與相應的濃度作線性方程。

2.2.4 專屬性、精密度、重復性、穩定性試驗

分別精密吸取“2.2.2”項下槲皮素和山奈酚標準溶液，及供試品溶液。按“2.2.1”項下色譜條件，分別進行6次測定，對儀器精密度及方法重復性進行考察。并考察樣品24小時內的穩定性。

2.2.5 加樣回收率實驗

精密稱取1 g已知含量槲皮素和山奈酚的大烏泡有效部位提取物樣品6份，加入對照品，按“2.2.2”項下的方法制備，按照“2.2.1”的色譜條件檢測。

2.2.6 樣品含量測定

按“2.2.2”項的方法制備樣品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣分析，記錄槲皮素和山奈酚的峰面積，采用外標一點法計算出大烏泡藥效部位中槲皮素和山奈酚的含量。

2.3 UV測定大烏泡中蘆丁的含量

2.3.1 對照品與樣品溶液的制備

精密量取蘆丁對照品10.00mg，用60%乙醇溶液定容至50mL容量瓶中，制備成濃度為0.2mg/mL的對照品溶液。精密稱取大烏泡有效部位提取物1 g，移至錐形瓶中，加入25mL甲醇溶液，稱重，超聲提取50min（80HZ，60℃），冷至室溫，補重，靜置濾過，為供試品溶液。

2.3.2 檢測波長的選擇

精密吸取蘆丁對照品溶液2mL，用60%乙醇溶液稀釋至10mL。精密吸取大烏泡供試品溶液1mL，將其轉移至10mL的容量瓶中，甲醇溶液稀釋至刻度。對照品及試品溶液分別進行200～800nm波長范圍內的全波長掃描。

2.3.4 線性關系考察

精密吸取蘆丁對照品溶液稀釋成一系列濃度（0.00501、0.01002、0.01503、0.02004、0.02505、0.03006mg/mL），375nm波長下測定吸光度。以濃度及其吸光度作線性回歸，得線性回歸方程。

2.3.5 精密度、重復性、穩定性試驗

精密吸取蘆丁標準溶液5mL，轉移至25mL容量瓶中，加入60%乙醇稀釋至刻度。375nm波長下測定吸光度，重復6次，計算其吸光度的RSD%。制備6份供試品溶液，每份精密吸取2 mL，加入甲醇溶液稀釋至10mL，計算其吸光度的RSD%。并考察樣品24小時內蘆丁含量的穩定性。

2.3.6 加樣回收試驗

稱取大烏泡有效部位提取物6份，每份約0.5 g，分別精密加入蘆丁對照品溶液，按“2.3.2”項下方法制備，375nm波長下測定吸光度，測定其含量的RSD%。

3 實驗結果

3.1 藥效試驗

與模型組比較，大烏泡70%乙醇提取物組、正丁醇、乙酸乙酯提取部位組能顯著緩解二甲苯對小鼠耳朵刺激而產生的腫脹，降低炎癥小鼠血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、轉化生長因子-β（TGF-β）水平。結果見圖1。

圖1 各組小鼠各項指標的檢測結果（±sD，n=8）

3.2 HPLC測定大烏泡中槲皮素、山奈酚的含量測定

3.2.1 線性關系的考察

結果見圖2。槲皮素回歸方程為：y=16334x+30160，r=0.9997，濃度在4.600～111.000μg/mL范圍內線性關系良好；山奈酚回歸方程為：y=14148x+2623.3，r=0.9996。濃度在1.250～125.000μg/mL范圍內線性關系良好。

圖2 槲皮素、山奈酚的線性回歸曲線

3.2.2 專屬性、精密度、重復性、穩定性試驗

色譜圖見圖3，對照品及樣品在相同色譜條件下進行測定，結果表明含量測定方法專屬性好。對照品及6份樣品溶液，測得槲皮素、山奈酚含量RSD%<3%，實驗精密度、重復性良好，結果見表1。24小時內，所測定有效成分槲皮素和山奈酚含量RSD<3%，樣品穩定性好，結果見表2。

表1 精密度和重復性結果（n=6）

表2 供試品溶液穩定性試驗結果（n=6）

圖3 山奈酚、槲皮素對照品和供試品溶液HPLC譜圖

3.2.3 加樣回收率實驗

結果見表3，大烏泡樣品含量測定方法回收率性良好。

表3 槲皮素、山奈酚加樣回收率（n=6）

3.2.4 樣品含量測定

三批大烏泡藥效提取部位槲皮素、山奈酚的含量見表4。

表4 大烏泡藥效部位中槲皮素和山奈酚含量測定的結果（n=3）

3.3 UV測定大烏泡中蘆丁的含量

3.3.1 線性關系考察

結果見圖4。槲皮素回歸方程為：y=24.511x +0.014，r=0.9994，濃度在0.00501～0.03006mg/mL范圍內線性關系良好。

圖4 蘆丁線性回歸曲線

3.3.2 精密度試驗

對照品重復進樣6次，及6份樣品溶液測得蘆丁峰面積RSD（%）<3%，實驗精密度、重復性良好，結果見表5。24小時內，所測定有效成分蘆丁含量RSD<3%，樣品穩定性好，穩定性結果見表6。

表5 精密度和重復性結果（n=6）

表6 穩定性考察（n=6）

3.3.3 加樣回收試驗

結果見表7，大烏泡藥效提取部位中蘆丁的含量測定方法回收率性良好。

表7 蘆丁加樣回收率考察（n=6）

3.3.4 大烏泡藥效提取部位中蘆丁的含量測定

三批大烏泡藥效提取部位中蘆丁含量見表8。

表8 蘆丁的含量（n=3）

4 討論

本課題通過抗炎藥效篩選實驗，篩選出正丁醇部位、乙酸乙酯部位為主要抗炎活性部位，而這兩個部位是黃酮類化合物聚集的主要部位，因此，大烏泡抗炎藥效物質基礎可能是黃酮類物質。本實驗以黃酮類成分槲皮素、山奈酚、蘆丁為指標成分，采用高效液相色譜法對山奈酚與槲皮素進行含量測定，采用紫外線-可見光分光度法對蘆丁進行含量檢測，槲皮素和山奈酚均在360～365nm波長處有較好的檢測效能。經過對檢測方法的專屬性、線性關系、精密度、重復性、穩定性、回收率等進行考察，結果顯示，大烏泡中有效成分的含量檢測方法，穩定可靠、重復性良好。

孟鑫、劉瑤等[12,13]根據大烏泡化合物的1H-NMR、13C-NMR譜圖進行綜合解析后發現，大烏泡正丁醇萃取部位化學成分主要為槲皮素和山奈酚。槲皮素具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節等多種藥理活性[14-19]。司天雷[20]在槲皮素體內外抗炎作用研究中發現，槲皮素體外能有效抑制前列腺素E2和一氧化氮表達，調控誘導型一氧化氮合成酶表達，抑制促炎細胞因子產生的作用；對內毒素血癥小鼠模型中促炎因子的基因表達有抑制作用，能夠有效控制促炎因子的合成與釋放。山奈酚能明顯抑制LPS誘導的人單核細胞MAPK通路的表達[21]。也可阻斷哮喘小鼠氣道上皮細胞Tyk-STAT信號通路，抑制STAT3的激活，有效抑制炎癥的發生[22]。蘆丁則可以通過抑制一些參與炎癥的細胞信號通路和關鍵酶的表達，產生抗炎作用[23]。綜上所述，槲皮素、山奈酚、蘆丁等成分可能是大烏泡發揮抗炎作用的關鍵活性成分。