基于網絡藥理學和分子對接探討桃仁
——紅花藥對治療缺血性腦卒中潛在機制

李平，夏文廣，鄭嬋娟，段璨，李正良 ，曹鈺卓，張荷玲

（1.湖北中醫藥大學，湖北 武漢 430000；2.湖北省中西醫結合醫院，湖北 武漢 430000；3.湖北省直屬機關醫院，湖北 武漢 430000）

0 引言

腦卒中是世界范圍內致死、致殘的主要原因之一，缺血性腦卒中是最常見的類型，約占60%～80%[1]。中醫將缺血性腦卒中歸屬于“中風”范疇，以益氣活血化瘀為主要治療方法[2]。紅花-桃仁藥對是活血化瘀的經典藥對，始于元代王好古所著《醫壘元戎》中的加味四物湯[3]。近年來桃仁、紅花在腦血管病中應用廣泛，但分子層面的作用機制尚不清楚，本研究通過網絡藥理學與分子對接技術預測桃仁-紅花藥對治療缺血性腦卒中的作用靶點與信號通路，為該藥對治療腦卒中提供臨床應用依據，并對中藥的研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 桃仁-紅花活性成分和靶點篩選

通過TCMSP平臺（Traditional Chinese Medicine Systerms Pharmacology）收集桃仁、紅花所有活性成分[4]，以口服利用度(OB)＞30%，類藥性(DL)＞0.18為標準[5]篩選活性成分。通過挖掘文獻補充被遺漏的活性成分。使用UniProt 數據庫得到活性成分相關靶點并對靶點進行規范化。

1.2 缺血性腦卒中相關靶點篩選

通過OMIM、GeneCards、TTD和DrugBank[6]數據庫得到缺血性腦卒中相關靶點。利用BioinfoGP中VENNY2.1工具，將藥物活性成分的預測靶點與疾病相關靶點進行交集分析并繪制韋恩圖，提取活性成分與疾病的交集靶點。

1.3 蛋白質互作網絡圖構建

將1.2中的交集靶點，導入STRING平臺繪制得到PPT（protein-protein interaction network）網絡圖和tsv文件。通過Cytoscape 3.7.2軟件中的CytoNCA包對PPI進行網絡拓撲學分析，進一步評估關鍵靶點并繪制網絡圖，利用CytoHubba插件計算度值≥19的Hub基因。

1.4 GO和KEGG分析

將交集靶點通過DAVID數據庫進行GO(Geneontology)富集分析和 KEGG( Kyoto encyclopedia of genes and genomes) 通路分析（人種設定為人）。

1.5 “活性成分-靶點-通路”網絡的構建

將藥對與疾病的活性成分-靶點-通路整理成Network文件和Type文件，上傳到Cytoscape 3.7.2，構建活性成分-靶點-通路網絡圖，分析網絡拓撲參數。

1.6 分子對接

對“活性成分-靶點-通路”網絡中度值排名靠前的靶點與活性成分進行分子對接驗證。通過 Pubchem 數據庫下載活性成分SDF格式文件，通過OpenBabel（version 2.4.1）轉換為MOL2格式；通過PDB數據庫下載PDB格式的靶點蛋白晶體結構。利用AutoDock Tools對結構進行去水、加氫等處理，通過AutoDock Vina進行分子對接，最后用Pymol軟件繪制分子對接示意圖。

2 結果

2.1 桃仁-紅花藥對中活性成分的篩選

TCMSP 數據庫檢索得到桃仁成分66個，紅花成分189個，以OB≥30%，DL≥0.18為篩選條件，共得到桃仁紅花活性成分各17個，查詢相關文獻[7]進行補充，去除重復值最終獲得34個潛在活性化合物，結果見表1。

表1 桃仁-紅花中的活性化合物

2.2 缺血性腦卒中相關靶點的篩選

共得到缺血性腦卒中相關靶點1202個，藥物成分靶點與疾病相關靶點交集韋恩圖如圖1所示，缺血性腦卒中與桃仁共有靶點32個，缺血性腦卒中與紅花共有靶點147個，缺血性腦卒中、桃仁、紅花潛在靶點總數為149個。

圖1 桃仁和紅花藥對與缺血性腦卒中靶點的韋恩圖

2.3 缺血性腦卒中與桃仁和紅花藥對共有靶點的 PPI 網絡及分析

通過STRING平臺得到缺血性腦卒中與桃仁和紅花藥對共有靶點的PPI網絡（見圖2），共有98個節點、2240條邊。根據度中心性[8](Degree Centrality，DC)＞19進一步確定關鍵靶點。按Degree值由大到小排序，統計出頻次前20的Hub基因并繪制條形圖（見圖3）橫坐標為靶點的度值。其中IL-6、ALB、AKT1、TNF、VEGFA度值顯著高于其余交集靶點，在PPI 網絡中起著重要的聯系作用。AKT1度值最大，可能是藥對治療缺血性腦卒中最主要的潛在靶點。

圖2 桃仁-紅花藥對治療缺血性腦卒中的關鍵靶點PPI網絡

圖3 前20個互作靶點

2.4 GO和KEGG分析

通過DAVID數據庫對交集靶基因進行GO富集分析及 KEGG 通路分析。使用微生信平臺對結果進行可視化處理。

GO富集分析包括BP(biological process)629條結果，CC（cellular component)74條結果，MF(molecular function) 148條結果，根據P值＜0.01從小到大排列，均選取前 20 條進行富集分析（圖4）。

圖4 共有靶點的GO生物學過程富集分析

KEGG富集分析涉及121條信號通路，根據P值＜0.01，FDR值＜0.05作為篩選條件，從小到大排列，選取前20條通路繪制氣泡圖（圖5）。

圖5 共有靶點的前20條 KEGG通路

2.5 “活性成分-核心靶點-通路”網絡的構建

“活性成分-核心靶點-通路”網絡如圖6所示，選擇KEGG 富集中Count值前10的信號通路，集中展示桃仁-紅花藥對作用靶點的所在通路。34個主要活性成分可能通過作用于149個靶點，在10條信號通路中發揮作用，表明桃仁和紅花藥對可能通過多成分、多靶點、多通路抑制腦卒中的發生發展。

圖6 “活性成分-核心靶點-通路”網絡

2.6 分子對接技術預測川芎-赤芍藥對活性成分與潛在靶點的結合能力

對Degre e值排名前十的核心活性成分與Degree值排名前五的關鍵靶點進行結合能力預測。一般認為小于-5.0kcal/mol有較好的結合活性，小于-7.0kcal/mol有強烈的結合活性[9]。結果發現β-谷固醇、羥基紅花黃色素A、木犀草素、山奈酚、赫達拉汀赤霉素7與ALB、AKT1和VEGFA有強烈的結合能力，見表2。通過PyMOL軟件對部分成分與靶點對接結果進行可視化，見圖7。

表2 核心活性成分與核心靶點結合能預測

圖7 核心活性成分與核心靶點對接結果

3 討論

本研究收集桃仁紅花藥對活性成分34個，通過網絡藥理學研究發現，桃仁-紅花藥對中活性成分度值最高的是槲皮素、豆淄醇、羥基紅花黃色素A、木犀草素、山奈酚等。研究表明這些化合物具有抗炎抗氧化、抑制細胞凋亡，改善微循環、保護血腦屏障，改善腦水腫和神經功能缺損等作用[10-13]。拓 撲分析和PPI網絡圖表明，ALB、IL-6、AKT1、TNF和VEGFA是桃仁-紅花治療缺血性腦卒中的關鍵靶點。研究發現血清白蛋白（ALB）[14]、白介素-6（IL-6）[15]在缺血性腦卒中后炎癥發生、發展過程中起著重要作用，腫瘤壞死因子（TNF）對細胞間黏附分子1的表達具有調節作用，可引發血管炎性，并誘導炎性細胞從血管內轉移至神經組織[16]，VEGFA可以促進血管生成，恢復缺血區的血液供應，起到保護神經元、減輕腦缺血損傷的作用[17]。GO富集結果分析表明，桃仁紅花治療缺血性腦血管病可能與氧化應激的反應、活性氧代謝、細胞凋亡調控等有關。研究[18]表明這些生物過程與神經系統的功能密切相關，參與了腦缺血的病理生理過程。KEGG富集結果提示TNF 信號通路、細胞凋亡通路、HIF-1 信號通路，PI3K-Akt 信號通路被顯著性富集，是桃仁-紅花治療缺血性腦卒中的主要通路。TNF信號通路可以介導血管內皮細胞上粘附分子的表達，促進中性粒細胞浸潤，影響血腦屏障通透性[19]。HIF-1信號通路在急性腦缺血時被激活，介導HIF-1α表達。相關研究表明，PI3K-Akt信號通路的激活與抑制與腦梗死有密切聯系[20]，特別是對腦缺血再灌注后氧化反應、血管生成、細胞凋亡等過程[21]及改善腦缺血再灌注損傷有重要作用[22-23]。分子對接結果顯示關鍵靶點與活性成分對接效果好，其中AKT1、ALB、VEGFA與10種主要活性成分的結合能均≤-7.0kcal/mol，表明有較強結合活性。由此推測關鍵靶點與主要成分結合可能是桃仁紅花發揮治療缺血性腦卒中的關鍵。

綜上所述，桃仁紅花主要通過槲皮素、山奈酚和木犀草素等活性成分，作用于AKT1、ALB、VEGFA、IL-6、ALB等關鍵靶點，調節炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡和血管新生等作用，進而調控細胞凋亡通路、 HIF-1信號通路、TNF信號通路、PI3-K/Akt信號通路等通路治療缺血性腦卒中。該結果為桃仁-紅花治療缺血性腦卒中作用機制提供理論指導。為2020湖北省科技重大專項基于湖北道地藥材的現代中藥創制技術提升提供參考。該藥對的劑量是否對治療效果有影響是我們下一步需要研究的問題。