黃連復方湯治療胃癌作用機制的網絡藥理學研究

申嗣琪，李發展，米陽，鄭鵬遠

(鄭州大學第五附屬醫院,河南 鄭州 450000)

0 引言

國際癌癥研究機構統計編制的Globocan2018年癌癥分析報告顯示：2018年全球超過100萬例胃癌新病例和78.3萬例胃癌死亡病例，胃癌成為全球第五大常見癌癥和第三大癌癥死亡原因[1]。胃癌由于早期缺乏相應癥狀，常確診于晚期，因此腫瘤晚期的侵襲和轉移是胃癌患者死亡的主要原因之一，胃癌晚期的治療常使用序貫化療[2]，但化療藥物為細胞毒性藥物，常導致抗癌過程中產生骨髓抑制等嚴重副作用，降低了患者生活質量甚至影響了抗癌效果[3]。研究發現，中藥具有多成分、多途徑、協同增效的特點，某些成分可有效防止腫瘤細胞的擴散和轉移，有著巨大的研究價值和應用前景[4]。

黃連復方湯來源于《圣濟總錄》卷一七八，包含黃連、干姜、艾葉、烏梅四味中草藥，具有平調寒熱、和胃降逆的功效，常用于治療感冒、腹瀉、腹痛等[5,6]，有研究發現烏梅和黃連均有一定抗腫瘤作用[7,8]，但因藥方活性成分多、作用靶點繁復，具體機制并未明確。

“網絡藥理學”這一概念由英國學者Hopkins首先提出[9]，認為藥物治療疾病的作用過程是“多成分-多靶點-多途徑”的[10]，因此網絡藥理學研究具有整體性和系統性，與中醫藥的辨證論治原則、整體觀念相合，可用于發現復雜中藥中的活性成分，進而識別靶標和預測適應證[11]。本研究以網絡藥理學方法篩選出了黃連復方湯治療胃癌的活性成分和主要作用基因靶標，預測了黃連復方湯治療胃癌的網絡藥理學作用機制。

1 方法

1.1 胃癌靶點-缺氧基因提取

從G S E A（Gene Set Enrichment Analysis）的基因集數據庫中，提取缺氧相關的基因。在TCGA（The Cancer Genome Atlas Program）的胃癌數據庫中尋找缺氧基因對應樣本表達量，進行差異分析，篩選出正常組織和胃癌組織差異表達的缺氧基因。

1.2 藥物活性成分及靶點篩選

使用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別檢索黃連復方湯含有的四種中藥成分：黃連、干姜、艾葉、烏梅，篩選其中同時符合口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18條件的活性成分，整理并收集對應的基因靶點。

1.3 蛋白互作（PPI）網絡構建與分析

將所獲藥物活性成分靶點與差異表達的缺氧基因導入Cytoscape 3.7.2軟件，繪制中藥成分與缺氧基因的聯系圖。在此軟件內，使用插件BisoGenet 3.0.0，勾選HPRD、BIND、DIP、MINT、INTACT、BIOGRID數據庫，設置顯示輸入的節點及相鄰節點，構建差異基因的蛋白互作網絡，使用插件CytoNCA分別按照Degree count（61-Max）和Betweenness count（70-Max）進行篩選。

1.4 基因富集分析

GO（Gene ontology）分析將基因功能分為生物過程（Biological process，BP）、細胞組分（Cellular component，CC）、分子功能（Molecular function，MF）三部分，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫是系統分析基因功能、鏈接基因組信息和功能信息的數據庫。在R軟件中，使用“clusterProfiler”，“richplot”and“ggplot2”對黃連湯復方相關的靶點基因進行GO功能和KEGG通路聚集分析，α=0.05為檢驗標準，以P＜0.05為篩選閾值。

2 結果

2.1 缺氧基因提取及差異分析

將正常組織和胃癌組織中缺氧基因的表達情況繪制火山圖，以FDR＜0.05，|logFC|＞1為條件篩選出胃癌組織中顯著上調或下調的缺氧基因，并繪制出相應火山圖和熱圖（圖1）。結果顯示，相較于正常組織，在胃癌組織中差異表達的缺氧基因一共42個，其中上調和下調的基因各21個。

圖1 缺氧基因表達差異分析

2.2 詞活性成分及基因靶點

符合OB≥30%，DL≥0.18的黃連復方湯活性成分共18個，包括Huanglian(黃連)7個，Ganjiang(干姜)5個，Aiye(艾葉)6個，Wumei(烏梅)6個，見表1?；钚猿煞謱?65個基因靶點，去重后獲得186個基因靶點。

表1 黃連復方湯活性成分及對應基因靶點

2.3 PPI篩選與分析

將藥物活性成分基因靶點與胃癌組織差異表達的基因做交叉分析，繪制藥物活性成分與缺氧基因的聯系圖(圖2)，其中JUN作為活性成分山柰酚、β-谷甾醇的基因靶點，FOS、HK2、SERPINE1、CAV1、CDKN1A、JUN、IGFBP3、VEGFA作為活性成分成分槲皮素的共有靶點。

圖2 活性成分與基因聯系圖

繪制差異基因的蛋白互作網絡圖(圖3 a)，并通過CytoNCA插件對PPI網絡進行功能分析，按照deg r ee值(DC＞61，圖3 b)和betweenness值(BC＞7 0，圖3c)篩選排序。其中，按degree值排名前1 5的靶點基因為CDKN1A(277)、JUN(273)、NTRK1(242)、TP53(237)、FOS(215)、C A V 1(1 9 9)、E S R 1(1 8 9)、A P P(1 8 2)、EP300(165)、UBC(158)、EGFR(158)、HSP90AA1(158)、CDK2(152)、FN1(140)、CREBBP(134)；按betweenness值排名前15的靶點基因為TP53(247.91)、EP300(139.08)、ESR1(1 3 5.1 0)、EGFR(1 3 4.6 1)、HSPA8(1 2 5.8 3)、NTRK1(1 2 5.7 5)、NPM1(12 4.53)、HSP 90A A1(118.7 6)、CDKN1A(1 0 4.3 5)、UBC(1 0 1.7 2)、JUN(90.35)、COPS5(87.77)、TUBB(84.96)、APP(84.45)、MYC(82.29)。

圖3 差異基因的蛋白互作網絡(PPI)

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將GO分析與KEGG分析結果(按P值升序排列)分別繪制成氣泡圖、柱狀圖，圖中氣泡大小及柱狀長短代表富集基因靶點的多少，氣泡及柱體顏色差異代表基因靶點富集的顯著性大小。

G O富集分析結果(圖4)列出黃連復方湯治療胃癌涉及的前5條生物過程(B P)，前5個細胞組分(C C)以及前5項分子功能(MF)。BP中，主要是對老化(aging)、對氧氣水平的反應(response to oxygen levels)、泌乳(lactation)、體液分泌(bodyfluid secretion)、乳腺發育(mammary gland development)等生物過程進行調節。CC中，主要對血小板α-顆粒腔(platelet alpha granule lumen)、血小板α-顆粒(platelet alpha granule)、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物(RNA polymeraseⅡtranscription regulator complex)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)、細胞質囊泡腔(cytoplasmic vesicle lumen) 等細胞組分有顯著作用。MF中，主要對SMAD相關蛋白結合(R-SMAD binding、SMAD binding)、纖維連接蛋白結合(fibronectin binding)、RNA聚合酶Ⅱ激活轉錄因子結合(RNA polymeraseⅡactivating transcription factor binding)、激活轉錄因子結合(activating transcription factor binding)等分子功能有顯著作用。

圖4 GO富集分析

KEGG通路富集分析結果(圖5，6)表明，黃連復方湯治療胃癌涉及富集潛在基因靶點最多的10條通路依次為缺氧誘導因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、血剪切應力和動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、腎細胞癌(Renal cell carcinoma)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、結直腸癌(Colorectal cancer)、類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis)、內分泌抵抗(Endocrine resistance)、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、恰加斯病(Chagas disease)。提示黃連復方湯可能通過以上通路治療胃癌。

圖5 KEGG通路富集分析

圖6 “基因靶向KEGG通路”相互作用的網絡圖

3 討論

中藥多為口服制劑，在體內需經過吸收、分布、代謝及排泄過程到達靶器官或組織發揮作用，此過程稱為中藥的藥動學特征(即ADME過程)，其中口服生物利用度(OB)與類藥性指數(DL)是中藥ADME過程的關鍵指標[4]。

本研究以OB≥30%和DL≥0.18為條件篩選到的黃連復方湯治療胃癌的主要活性成分為山柰酚、β-谷甾醇和槲皮素等，均已被研究證實具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、增強免疫功能等作用[12-19]，說明這幾種活性成分可能是黃連復方湯治療胃癌的藥效基礎。通過活性成分與基因聯系圖和蛋白互作網絡(PPI)分析發現JUN、CDKN1A、FOS、HK2、SERPINE1、CAV1、IGFBP3、VEGFA等可能是黃連復方湯治療胃癌的作用靶點。以PPI分析所得degree值排名靠前的關鍵靶點為例：Kaya等研究表明，CDKN1A基因是參與癌癥發病機制的重要腫瘤抑制因子[20]，Shi等研究表明，由CDKN1A基因編碼的p21蛋白是CDK抑制劑的重要成員，p21被廣泛稱為腫瘤抑制因子，但p21還可以通過促進細胞周期進展抑制細胞凋亡，以及有利于遷移而起到致癌因子的作用，因此p21在癌癥中起到了抑制因子或啟動子的雙重作用[21]，需要進一步研究以確定其作為單個癌實體治療分子靶標的效用。研究表明，AP-1轉錄復合物主要由JUN和FOS蛋白家族的成員組成，而AP-1轉錄復合物參與細胞增殖、分化和凋亡過程，與癌癥的發展和轉移密切相關，但與此同時，JUN、FOS蛋白被認為可以發揮腫瘤抑制功能[22,23]。

GO富集分析中，BP分析表明，細胞的老化及對氧氣水平的反應等生物過程受到最顯著的影響，說明這些基因主要參與細胞基礎活動的調控；CC分析表明，說明這些基因主要與血小板α-顆粒腔、血小板α-顆粒等細胞間質和細胞質相關細胞組分的形成或作用通路有關；MF分析表明，這些基因主要參與藥物產生藥效過程中的蛋白、酶、轉錄因子等分子功能。

KEGG通路分析結果表明黃連復方湯治療胃癌相關缺氧基因富集的主要通路包括HIF-1信號通路、血剪切應力和動脈粥樣硬化、p53信號通路等。以HIF-1信號通路為例進行分析：缺氧始終存在于腫瘤微環境中，是實體瘤的內在特征之一，與腫瘤的侵襲性表型有關[24]，對缺氧的大多數反應是一系列缺氧誘導因子(HIF)引起的，這些轉錄因子誘導各種基因的表達，這些基因有助于細胞適應缺氧環境，其中HIF-1在癌癥進展中的作用已經得到充分證實，HIF-1作為信號傳導中心，協調影響腫瘤發生的許多轉錄因子和信號分子的活動，包括腫瘤的轉移和復發等[25,26]。

4 小結

黃連復方湯中的山柰酚、β-谷甾醇和槲皮素成分可能作用于JUN、CDKN1A等缺氧基因是黃連復方湯治療胃癌的作用機制，主要為對細胞老化及對氧氣水平的反應過程的調控，并涉及HIF-1信號通路、血流剪切應力和動脈粥樣硬化等。本研究為研究黃連復方湯治療胃癌提供了初步探討與預測，可為后期相關研究提供理論支持。