Calu-3細胞氣液界面培養及暴露研究的初探

李銀霞，盛云華，胡 玥，唐黎明

(1. 復旦大學藥學院，上海 201203；2. 中國醫藥工業研究總院，上海 201210； 3. 上海市食品藥品檢驗研究院，上海 201203)

呼吸道細胞每天暴露在各種氣體、氣溶膠、粉塵顆粒或是藥物中，是吸入毒理和藥物遞送等研究的重點對象[1]。用于科學實驗研究的呼吸道細胞類型有很多，如A549(人肺癌細胞)、Calu-3(人肺腺癌細胞)、BEAS-2B (人支氣管上皮樣細胞)、hAELVi(永生化的人類肺泡上皮細胞)、NCI-H460(人大細胞肺癌細胞)、WI-38(人胚胎肺細胞)等細胞系細胞，還有原代細胞[2]。不同部位的細胞其功能也不相同，用于實驗的目的也不盡相同，支氣管上皮細胞BEAS-2B用作篩選具有潛在肺毒性或致癌的化學品、納米金屬顆粒等的細胞模型[3]。A549細胞形成的融合單層，具有II型肺泡上皮的特征形態，有助于研究肺泡II型細胞對肺上皮藥物遞送機制的代謝和大分子加工[4]。Calu-3細胞作為肺上皮細胞的代表，具有細胞通透性、緊密連接以及蛋白表達的特點[5]。體外-體內相關性研究表明，Calu-3細胞培養模型是預測吸入給藥候選藥物的潛在模型[6]，建議將Calu-3細胞作為篩選呼吸道刺激和空氣中化學物質毒性的合適細胞株[7]，且Calu-3細胞在氣液界面培養時仍可存活數周、屏障能保持完整性、不會過度生長、并且易于培養和維護[8]；Grainger等[9]通過比較液體覆蓋培養(LCC)和空氣液體界面培養(air-liquid interface，ALI)對Calu-3細胞層形態和滲透性的影響得出結論，使用ALI培養的細胞生成的模型在形態學上更能代表氣道上皮，細胞呈更明顯的柱狀上皮、有微絨毛和更多的糖蛋白分泌，細胞的滲透性也強于液體覆蓋培養的細胞；Ji等[10]建立了Calu-3細胞模型證實了Calu-3細胞在氣液界面培養下的形態和生物電學特征以及蛋白特性的表達，模型中Calu-3細胞上皮表現出明顯的分化、緊密連接形成和微絨毛樣結構，并產生更多的粘液。因此，本論文主要研究Calu-3細胞模型。

在傳統的吸入毒理研究中，大多染毒方式采用浸沒式暴露方式，即將受試物溶解在細胞的培養液中進行暴露，隨后觀察細胞的后續變化，這種暴露方式難以避免受試物與培養基的相互作用，且難以反映實際吸入暴露的情況。隨著氣液界面培養方式的推行發展出新型暴露系統，可以將氣溶膠直接暴露于細胞表面，不僅解決了上述問題，還更接近人體生理實際暴露情況。VITROCELL云系統在煙草吸入毒理、藥物遞送方向應用較多，云系統和連續流暴露系統區別在于受試物沉降機制和暴露時長，云暴露系統的沉降機制是云沉降，連續流暴露系統的沉降機制是擴散和沉降[11]；云暴露系統大多在5 min內完成受試物的暴露，而連續流系統則可以在細胞耐受范圍內持續暴露，對比云暴露系統，連續流暴露系統更適用于環境毒理學以及吸入毒理學的研究。本研究采用細胞氣液界面培養方式結合VITROCELL連續流暴露系統來進行細胞氣液界面暴露實驗，此系統可以將受試物以氣溶膠的形式均勻且連續地暴露于細胞表面，氣溶膠混合物通過VITROCELL喇叭形管口垂直輸送到細胞表面(Fig 1)，在暴露細胞的小室中氣溶膠混合物的流動是平滑的和層狀的，很大程度限制了可能會損害細胞的剪切力和潛在的水分損失，保證了濕度，通過VITROCELL體外暴露系統再現人體呼吸道細胞在接觸外界時的真實情況，比傳統的浸沒式暴露更具有說服力。此系統(Fig 1)由3部分組成，形成氣溶膠的發生裝置、可以定量的稀釋系統模塊和可以溫控的暴露模塊，在系統的暴露模塊中，有3孔是空氣暴露對照組，9孔是實驗受試物暴露組，受試物暴露組又可以細分為高中低3個劑量組。暴露時長是評價化合物吸入毒性的1個基本影響因素，本文主要通過潔凈空氣暴露后細胞的活性和電阻值的考察，確定細胞的單次最長暴露時間，為后續化合物體外吸入毒性評價研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株Calu-3細胞株(北納生物，編號2017033104，通過STR基因型檢測，與ATCC數據庫完全匹配，實驗所用細胞代數均在20代之內)。

1.2 主要儀器Heracell VIOS 160i CO2培養箱(Thermo Scientific公司，德國)；BCM-1300A層流超凈臺(Airtech公司)；Vi-cell XR細胞活力測定儀(Beckman counter公司，德國)；EVOM 2上皮電阻儀和STX2電極(世界精密儀器公司，美國)；VITROCELL?12/12暴露染毒系統(型號VITROCELL?12/12 CF，VITROCELL，德國)；SpectraMax M5多功能酶標儀(美國Molecular Devices公司)；THUNDER Imager 3D Live Cell(德國Leica公司)。

Fig 1 VITROCELL12 in vitro inhalation exposure system

1.3 主要試劑與耗材MEM培養基(批號2192541，Corning)；胎牛血清(FBS，批號DBC0520，Hyclone)；PBS緩沖液(批號21020007，Corning)；青霉素-鏈霉素(雙抗，批號10378016，Thermo)；胰蛋白酶-EDTA(批號10165921001，Gibco)；CCK-8試劑(日本同仁化學研究所)；抗體ZO-1(Cell Signaling Technology，貨號：#3195)；Anti-Rabbit IgG(Cell Signaling Technology，貨號：#4412)；牛血清蛋白(BSA，批號abs9157，absin)；抗熒光淬滅封片液(批號P0126，Beyotime)；DAPI(批號C1006，Beyotime)；細胞培養瓶(25 cm2，Corning，美國)；Transwell-12孔板(面積為1.12 cm2，孔徑為0.4 μm，Corning公司，美國)。

1.4 實驗方法

1.4.1Calu-3細胞ALI培養 Calu-3細胞在細胞培養瓶中擴增，培養液為5 mL的完全培養基(MEM，10% FBS，1%雙抗)，細胞置于37°、5% CO2的培養箱中培養，隔天換1次培養液，細胞在顯微鏡下觀察，當細胞達到90%融合時進行傳代。經過傳代3次之后將細胞用胰蛋白酶-EDTA消化，使用細胞計數儀計數，加入完全培養基重懸細胞，使細胞的密度約為2×108個·L-1，以每孔500 μL的細胞混懸液接種在Tranwell小室中，底室中加入1 mL完全培養基。顯微鏡下觀察細胞，當細胞在Transwell膜中長滿則棄去Transwell小室中的培養基，之后只在底室供給培養液，開始氣液界面培養，記作ALI d 0，隔天換1次培養液。

1.4.2Calu-3細胞電阻值測量 在Transwell小室中加入500 μL的培養基，在培養箱中平衡20至30 min，連接電阻儀，在Transwell小室中插入電極頭，開始測量、讀數，每孔測定3個不同位置，求平均值，減去空白孔的值后，與Transwell膜表面積(1.12 cm2)的乘積即是該孔的跨上皮電阻(trans-epithelium electrical resistant,TEER)[12]。測量完成之后，棄去小室和底室的培養液，用PBS清洗2次，加入新鮮的完全培養液，繼續培養。Calu-3細胞ALI培養0～24 d內隔天測1次電阻值，暴露實驗在暴露完成24 h后測量電阻值。

1.4.3免疫熒光標記方法 將氣液界面培養d 1、4、8、16的Calu-3細胞用PBS清洗細胞3次；加入4%多聚甲醛固定20 min，完成后PBS清洗3次；加入0.2% Triton破膜15 min，結束后PBS清洗3次；加入5% BSA封閉、搖晃1 h，完成后PBS清洗3次；將Transwell濾膜裁剪下來，放在合適容器中，加入按比例稀釋好的一抗，4 ℃搖床搖晃過夜；d 2取出濾膜，PBS清洗3次；避光加入按比例稀釋好的二抗，搖床孵育2 h，結束后PBS清洗3次；加入DAPI染核10 min，完成后PBS清洗3次；將濾膜放到載玻片上，滴加抗熒光淬滅封片液，蓋上蓋玻片，制片完成，使用熒光微鏡進行觀察拍照。

1.4.4Calu-3細胞吸入暴露 在VITROCELL體外暴露系統(Fig 1)中進行潔凈空氣暴露。提前打開VITROCELL暴露系統的溫控和水浴裝置，等待升溫，達到37 ℃之后，底室各加入3 mL預熱的37 ℃ MEM培養液(不含FBS)，將ALI d 11的Calu-3細胞放入其中進行潔凈空氣暴露1、2、3、4、5、6 h，潔凈空氣流速為5 mL·min-1，與此同時對照組細胞的培養液也換成不含FBS的MEM培養液在培養箱中培養1、2、3、4、5、6 h，第2次暴露實驗取ALI 3 d的細胞，第3次暴露實驗取ALI- d 16的細胞，隨機抽取1至18 d內的細胞。

1.4.5Calu-3細胞暴露后活性測定 在VITROCELL體外暴露系統中暴露1、2、3、4、5、6 h后，將帶有Calu-3細胞的Transwell小室回收，培養箱培養24 h后在Transwell小室中加入CCK-8混合液(CCK-8 ∶MEM=1 ∶10)110 μL，培養箱培養1 h，將反應液加入96孔板，每孔110 μL，酶標儀于450 nm處讀取吸光度值，細胞活性的計算公式如下：

其中，Aexposure為暴露組吸光度值，Acontrol為對照組吸光度值，Ablank為空白孔(無細胞，只有CCK-8和MEM)的吸光度值。

2 結果

2.1 ALI培養的Calu-3細胞

2.1.1細胞轉為ALI培養天數 Calu-3細胞從液液培養模式轉為氣液培養模式的標準是Transwell膜上的細胞長滿(Tab 1)，細胞需要約(8±1) d的時間從液液培養轉為ALI培養(實驗天數取整數)。

Tab 1 Days of conversion of Calu-3 cells to ALI

2.1.2細胞電阻值 Calu-3細胞的電阻值測量結果如Fig 2所示，Calu-3細胞在氣液界面培養后的1～18 d內，細胞TEER ≥ 500 Ω·cm2，細胞間緊密連接形成總體穩定，細胞的狀態可以用于后續暴露實驗。

2.1.3免疫熒光標記 使用ZO-1抗體對氣液界面d 1、4、8、16的細胞進行標記，DAPI標記細胞核，結果如Fig 3所示，細胞緊密連接蛋白ZO-1表達明顯，細胞排列緊密，且隨著培養時間的推移，細胞生長的數量越來越多，細胞逐漸堆積，在氣液界面培養1～18 d內細胞間的緊密連接完整且穩定，細胞屏障形成，細胞狀態可以用于氣液界面暴露。

Fig 2 Changes of TEER value of Calu-3 cells

Fig 3 Expression of tight junction protein ZO-1 in Calu-3 cells in different stages of ALI culture(scale bar=50 μm)

2.2 細胞暴露后的活性檢測取ALI-3、11、16 d的Calu-3細胞暴露1、2、3、4、5、6 h，暴露結束后培養箱中培養24 h，通過CCK-8方法測定細胞活性，結果如Fig 4所示。潔凈空氣暴露6 h細胞的活性明顯低于培養箱對照組(P<0.01)，其中潔凈空氣暴露1、3、4、5 h后細胞活性下降但沒有統計學差異，潔凈空氣暴露2 h細胞活性上升。根據暴露后細胞活性結果顯示，在連續潔凈空氣暴露下Calu-3細胞的單次最長暴露時間不宜超過5 h。

Fig 4 Calu-3 cell viability changes with **P<0.01 vs control

2.3 細胞暴露后電阻值檢測Calu-3細胞結束暴露之后培養箱培養24 h測定電阻值，測定培養箱對照組的電阻值，每個時間點單獨設置對照組，實驗結果如Fig 5所示。Calu-3細胞潔凈空氣暴露之后的電阻值對比培養箱對照組細胞的電阻值均有所下降，且空氣暴露4、5、6 h后細胞電阻值對比培養箱對照組細胞有顯著性差異(P<0.05，P<0.01，P<0.01)。根據連續潔凈空氣暴露后Calu-3細胞電阻值結果顯示，單次最長暴露時間不宜超過3 h。

Fig 5 Changes of resistance value of Calu-3 cells with increasing air exposure

3 討論

成熟的細胞模型以及可控的體外暴露系統可以極大地促進細胞體外暴露實驗發展，體外細胞培養不僅解決了動物倫理的問題，使用人源細胞也可以減少種屬間的差異，更大程度上的還原了人在暴露時的真實情況，研究結果更具說服力。相應的細胞暴露方式也在進一步發展，從簡單的浸沒式暴露方式到現在的氣液界面暴露，模擬了外界化合物進入人體呼吸道的過程，使得體外吸入毒性評價實驗更完善。

TEER是表示Calu-3細胞屏障功能完整性的一個重要指標[13]，值越高細胞間的連接越緊密，實驗研究證明，當ALI培養的Calu-3細胞的TEER值達到500～800 Ω·cm2時[14]，已經形成緊密連接的上皮；緊密連接是粘膜上皮物理屏障的重要結構，緊密連接蛋白ZO-1是其重要組成蛋白之一[15]。本研究采用氣液界面培養Calu-3細胞，通過培養期間的細胞電阻值和緊密連接蛋白ZO-1的表達判斷細胞屏障是否形成，以確定細胞狀態是否可以用于暴露實驗，在實驗中細胞在氣液界面培養1～18 d電阻值穩定且 ≥ 500 Ω·cm2，緊密連接蛋白ZO-1表達明顯，成功培養出具有完整屏障功能的Calu-3細胞模型。成熟的Calu-3細胞模型還可以應用于環境毒理學[16]、肺部藥物遞送[17]等研究，期待更進一步的探索。

VITROCELL體外暴露系統于體外暴露評價化合物吸入毒性來說，需要解決暴露時長、受試物暴露劑量的準確性、受試物的沉積量和暴露的均一性等一系列問題。本研究將Calu-3細胞僅暴露于潔凈空氣中，探索細胞在VITROCELL?12連續流暴露系統中的單次最長暴露時間，ALI培養1至18 d的Calu-3細胞可以用于氣液界面暴露實驗，綜合分析Calu-3細胞潔凈空氣暴露之后的細胞活性和電阻值變化實驗結果，Calu-3細胞在VITROCELL?12體外暴露系統中的單次最長暴露時間為3 h。本文后續此系統相關條件的摸索提供了參考條件，具有重要意義，這只是初步的一個探索，此系統在吸入毒理學的應用研究則期待更深入的探索。