巴西橡膠樹YABBY基因家族鑒定及表達分析

張鴻韜，肖小虎，陽江華，秦云霞，龍翔宇，殷紅彥，方永軍*

巴西橡膠樹YABBY基因家族鑒定及表達分析

張鴻韜1,2，肖小虎2，陽江華2，秦云霞2，龍翔宇2，殷紅彥1，方永軍2*

1. 海南大學熱帶作物學院，海南海口 570228；2. 中國熱帶農業科學院橡膠研究所/農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南?？?571101

YABBY基因家族是一類植物特有的轉錄因子，在植物葉片和花器官的發育以及非生物脅迫應答中起重要的調控作用。本研究從橡膠樹基因組中鑒定得到11個HbYABBY家族成員，并從基因結構、啟動子順式作用元件、染色體定位、系統進化及基因表達等方面進行分析。結果顯示11個橡膠樹HbYABBY基因分布在9條染色體上，編碼蛋白的長度在132～241個氨基酸，分子量在14.75～26.41 kDa，啟動子區域含有豐富的光響應元件。該基因家族具有顯著的組織表達特異性，葉片和花中高表達，而在膠乳和根中基本不表達。葉片的發育過程中，除上調表達，另外9個HbYABBY基因均顯著持續下調表達，表明深度參與橡膠樹葉片發育調控。轉錄組測序和熒光定量檢測均發現所有成員受高溫誘導持續下調表達，但不受低溫脅迫誘導，暗示了HbYABBY在橡膠樹的高溫脅迫中發揮調控作用。本研究以熱帶經濟林木巴西橡膠樹為研究對象，對YABBY轉錄因子基因家族的理化特征、表達及功能進行了初步分析，為該基因家族功能的深度研究提供了理論依據和參考。

巴西橡膠樹；YABBY基因家族；轉錄因子；基因表達分析

YABBY基因家族是植物特有的一類轉錄因子，屬于鋅指蛋白超家族的亞族，該亞家族成員蛋白序列在N端具有保守的C2C2的鋅指結構域，C端具有螺旋-環-螺旋狀的結構域（稱為YABBY結構域）[1-2]。YABBY基因家族的表達和功能在植物中獲得廣泛研究，它們不僅參與植物葉片極性建立、花器官生長發育調控、植物遠軸極性形成[3]，還參與干旱、鹽等非生物脅迫應答和脫落酸（ABA）等激素信號轉導[4]。擬南芥中YABBY家族成員通過異位表達參與側生器官和遠軸細胞的形成發育[5]，白菜中參與葉球的發育[6]，棉花中GhYABBY家族成員參與胚珠、花、蕾和頂端分生組織發育調控[7-8]。此外，在玉米、水稻、草莓等植物中也發現YABBY基因家族參與分生組織、葉片及果實等的發育調控[9-11]。除了調控生長發育，還參與激素信號傳導和脅迫應答，水稻反饋調節赤霉素的合成[12-13]，小麥的可能通過對脫落酸與茉莉酸甲酯信號應答對抗逆性發揮重要作用[14]。大豆的YABBY家族成員、和參與干旱、鹽和脫落酸（ABA）脅迫等非生物脅迫[15]。草莓中與茉莉酸ZIM結構域蛋白互作參與鹽脅迫反應[16]。YABBY轉錄因子可以通過光響應元件調控轉錄發揮作用，如過表達能提高兩頭毛（）花青素的含量與葉片光合作用的能力[17]，甘蔗參與糖運輸和光合作用的調控[18]。

天然橡膠作為四大工業原料之一，在國民經濟發展和國防建設中有著不可替代的重要作用[19]。巴西橡膠樹（）是天然橡膠的幾乎唯一來源[20-21]，是我國及世界熱區的重要經濟作物。我國為非傳統植膠區[22]，是世界上最大的天然橡膠消費國和天然橡膠進口國。開展橡膠樹的分子生物學研究對于產業發展和保障戰略安全均具有重要意義。轉錄調控因子YABBY基因家族在植物中廣泛存在且具有重要作用，但橡膠樹中尚未見相關的研究報道，本課題基于‘熱研7-33-97’全基因組圖譜結合轉錄組測序數據，鑒定到橡膠樹11個YABBY家族成員，并對其從基因結構、啟動子調控元件、染色體定位與共線性、系統進化及基因表達等方面進行分析，研究結果初步闡明橡膠樹YABBY基因家族特性，為該基因家族功能的深入解析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所采用的試驗材料為定植于海南省儋州市中國熱帶農業科學院試驗場的橡膠樹品系‘熱研7-33-97’，試驗用樹正常開割3年，不同組織（膠乳、樹皮、葉片、雄花、雌花、種子和根）均取自于該材料。

1.2 方法

1.2.1 HbYABBY基因家族成員鑒定及其理化性質分析 利用PlantTFdb數據庫中的擬南芥YABBY蛋白序列進行BLAST比對搜索和PFAM數據的YABBY隱馬科夫模型文件進行HMMER檢索，分別篩選橡膠樹YABBY蛋白，候選蛋白去除冗余后通過NCBI數據庫的CDD進行保守結構域檢測，最終得到11個HbYABBY家族成員。分別利用在線工具網站Plant-mPLoc（http://www. csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）和ExPASy Prot Param（https://web.expasy.org/protparam/）進行亞細胞定位、等電點和分子量計算。

1.2.2 HbYABBY染色體定位、基因結構、啟動子及家族進化分析 根據橡膠樹基因組注釋信息文件進行基因結構、染色體定位以及共線性關系分析；分別利用NCBI Batch CD-search與MEME （https://meme-suite.org/meme/）網站在線進行保守結構域和motif預測[23]；通過Perl腳本截取基因上游2000 bp作為啟動子區域，利用PlantCARE在線進行順式作用元件分析；從PlantTFdb數據庫下載模式植物擬南芥，以及大戟科植物蓖麻、木薯、麻風樹的YABBY蛋白序列，通過DNAMAN進行蛋白序列聯配，再用MEGA11的neighbor-joinin法構建系統進化樹[24]，Bootstrap method設置為1000；最后通過TBtools軟件將結果進行圖示化[25]，并用AI軟件進行編輯美化。

1.2.3 橡膠樹基因差異表達分析 分別對橡膠樹基因不同組織、葉片發育時期、胚發育時期以及高低溫處理葉片樣品進行RNA提取，送公司采用Hiseq平臺進行雙末端測序，數據前處理后進行有參轉錄組分析，計算每個轉錄本的FPKM值表示表達量，并將結果以熱圖形式展示。

熒光定量試驗中，利用在線網站NCBI Primer-BLAST（https://www.ncbi. nlm.nih. gov/ tools/primer-blast/index.cgi）設計特異性引物（表1）。用RNA Easy Fast分別提取橡膠樹‘熱研7-33-97’葉片發育4個時期（古銅期、變色期、淡綠期、亮綠期）的總RNA，再用大連寶生物公司的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA第一鏈。以葉片4個時期cDNA為模板，采用TB Green? Premix Ex Taq?進行RT-qPCR。選擇18S rRNA為表達內參基因，使用2–ΔΔCT法對熒光定量結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹HbYABBY基因家族成員鑒定與理化特性分析

利用模式植物擬南芥的YABBY蛋白序列和橡膠樹蛋白序列集，分別進行同源比對和隱馬科夫模型檢索預測橡膠樹基因，在去除冗余及結構域分析后最終得到11個HbYABBY基因家族成員，根據擬南芥YABBY亞組成員，分別命名為、、、、、、、、、和。分析結果顯示，HbYABBY內含子數量保守在5～6個不等，蛋白序列長度在132～241（aa）之間，分子量分布在14.75～26.41（kDa），等電點在6.25～9.38之間，除HbYAB1d親水系數大于0，其余成員在–0.934～ –0.161之間，說明大部分成員為親水蛋白，亞細胞定位預測結果顯示，YABBY定位在細胞核且不存在信號肽（表2）。

表1 本研究所使用RT-qPCR引物

2.2 橡膠樹HbYABBY染色體定位及共線性分析

利用本實驗室完成的橡膠樹染色體基因組序列和注釋結果進行HbYABBY家族成員的染色體定位和共線性分析。如圖1所示，11個HbYABBY家族成員分別分布在LG01、LG03、LG05、LG07、LG08、LG09、LG14、LG15和LG18共9條染色體上，除14號染色體含有、和三個基因外，其他8條染色體均只有1個家族成員。其中3號、9號以及14號染色體該基因區段具有共線性關系，推測在基因組進化過程中可能發生了2次大片段重復且插入不同染色體區域。14號染色體上的和的共線性關系暗示了該染色體內部曾經發生大片段重復和插入事件。此外，15號和18號染色體上的和也為共線性關系。以上結果表明，橡膠樹基因主要伴隨染色體大片段復制而擴張。

表2 HbYABBY基因理化性質分析

圖1 HbYABBY基因家族染色體定位及共線性分析

2.3 橡膠樹HbYABBY蛋白結構分析

擬南芥AtYABBY蛋白序列含有2個保守結構，即在N端的鋅指結構域（zinc finger-like）和C端的YABBY（Helix-loop-helix）結構域[26]。通過與擬南芥AtYABBY基因家族成員的氨基酸多序列比對發現，橡膠樹HbYABBY基因家族與擬南芥結構域基本一致，同樣存在N端的鋅指結構域和C端的YABBY結構域（圖2A）。系統進化分析顯示，橡膠樹YABBY基因家族成員均成對出現（HbYAB1a與HbYAB1b；HbYAB1c與HbYAB1d；HbYAB5a與HbYAB5b；HbCRC1與HbCRC2；HbYAB2a與HbYAB2b），具有共線性關系的基因聚為一類（圖2B）。通過橡膠樹基因組注釋文件和HbYABBY蛋白序列進行的基因結構（外顯子、內含子）分析表明，HbYABBY家族成員的內含子數量較保守均在5～6個之間，成對基因的基因大小和結構更為一致（圖2C）。利用NCBI蛋白保守結構域數據庫掃描顯示橡膠樹所有家族成員均含有YABBY家族或超家族保守結構域（圖2D）。通過MEME鑒定到3個motif，不同成員motif數量在1～3個不等，相同進化分支成員的motif種類和數量更為接近，但也存在motif缺失情況，如HbYAB1d相對于HbYAB1a、HbYAB1b和HbYAB1c少了motif1，HbYAB5b相對于HbYAB5a也少了motif1，說明基因復制后又發生了獨立的進化（圖2E）。

圖2 橡膠樹HbYABBY蛋白序列結構特征

2.4 橡膠樹HbYABBY基因啟動子分析

分別截取11個基因起始位點上游的2000 bp序列作為基因啟動子區，利用在線工具PlantCARE預測啟動子區可能存在的順式作用元件，鑒定到光響應元件65個、茉莉酸甲酯響應16個、赤霉素響應10個、厭氧誘導21個、低溫響應5個、脫落酸響應12個、水楊酸響應7個、逆境應答響應7個、分生組織響應3個、愈傷響應2個（圖3），表明可能參與多種植物激素和環境脅迫應答，并在植物生長發育中起作用。特別是光響應元件，存在于全部11個基因的啟動子區且數量眾多在2～8個不等，預示著該基因家族在光應答和光形態建成中發揮重要的作用。此外有9個成員（除和外的）啟動子區含有赤霉素響應元件，8個成員啟動子區含有厭氧誘導元件，7個成員含有茉莉酸甲酯響應元件水楊酸響應元件，6個成員含有脫落酸響應元件和逆境應答響應元件，4個成員含有低溫響應元件，2個成員含有愈傷響應元件和分生組織響應元件（圖3）。進一步研究發現，蛋白序列高度同源的基因對的啟動子區作用元件種類和數量存在較大差異，預示了基因擴增后的功能分化。

圖3 橡膠樹HbYABBY基因啟動子區順式作用元件示意圖

2.5 橡膠樹HbYABBY基因家族進化分析

從PlantTFdb中下載模式植物擬南芥（7個）及大戟科植物木薯（15個）、蓖麻（6個）、麻風樹（8個）YABBY家族蛋白序列與本研究鑒定得到的11個橡膠樹YABBY家族成員，共計47個蛋白序列進行系統進化樹構建。分析結果顯示植物YABBY家族可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四個亞組，橡膠樹HbYABBY家族成員僅存在于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亞組中，其中亞組Ⅰ中包括HbYAB1a、HbYAB1b、HbYAB1c、HbYAB1d和HbCRC2五個成員。亞組Ⅱ中包含HbYAB4a和HbCRC1兩個成員。亞組Ⅲ中包含HbYAB2a、HbYAB2b、HbYAB5a和HbYAB5b四個成員（圖4）。同一分支中橡膠樹與木薯YABBY聚集在一起，反映了橡膠樹和木薯較近的系統進化親緣關系。此外，4個同源基因對（HbYAB1a和HbYAB1b；HbYAB1c和HbYAB1d；HbYAB2a和HbYAB2b；HbYAB5a和HbYAB5b）蛋白在進化樹上的位置與基因結構分析結果一致。

2.6 橡膠樹HbYABBY基因家族表達分析

橡膠樹不同組織中HbYABBY基因的表達分析表明該家族成員具有顯著的組織表達特異性，主要在葉片、雌花和雄花中表達，而在膠乳、根、樹皮和種子中極低表達或不表達，其中在所有組織中均不表達。葉片中表達豐度最高的依次是、和，另外有3個基因、和在葉片中不表達。雌花中表達豐度最高的依次是、、、、和，其他成員均為中低豐度表達。雄花中表達豐度最高的依次是、和，其他成員為低表達或不表達（圖5）。以上結果預示了HbYABBY基因家族在橡膠樹中主要參與光形態建成和生長發育，而對膠乳合成作用不明顯。

在胚中和兩個基因表達豐度最高，并且在發育過程中持續高表達，但變化趨勢不明顯。、和在胚中低豐度表達，并且隨胚的發育表達上調，分別在第10天達到最高峰值。和低豐度表達，且在發育過程中變化趨勢不明顯。此外，成員和在胚中不表達（圖6）。

葉片中除了和不表達外，其余9個基因均中高表達。在葉片發育過程中基因呈略微上調表達趨勢，而其余8個基因（、、、、、、和）均呈顯著下調表達趨勢，即在古銅期表達豐度最高，此后遞減，在亮綠期達到最低值。同源基因對和在古銅期葉片中FPKM值分別高達299.46和167.05，到了成熟的亮綠期幾乎不表達（圖6），它們參與葉片發育的調控機制需要進一步的研究。此外，本課題組在分析橡膠樹葉片分別進行45℃高溫與4℃低溫脅迫處理的表達模式發現，高溫處理下HbYABBY整體呈下調表達，其中、、和隨處理時間增加表達下降趨勢明顯，處理前后下調幅度達2倍以上。低溫處理中HbYABB所有成員的表達均沒有明顯變化（圖7）?；騾⑴c高溫脅迫應答反應，有助于橡膠樹對熱帶高溫環境的適應。

鑒于轉錄組分析結果中HbYABBY基因在橡膠樹葉片形態建成中的明顯作用，本研究選擇了6個在葉片發育過程中表達變化趨勢明顯的家族基因成員設計引物，以古銅期、變色期、淡綠期和亮綠期葉片RNA為模版進行RT-qPCR實驗，驗證它們的表達特征和趨勢，并與轉錄組測序數據分析結果進行比較。結果如圖8所示，、和三個基因無論在整體表達趨勢還是各個階段的表達變化幅度在RNA-seq和熒光定量分析結果中高度一致。和雖然在不同發育階段的2種實驗中表達水平變化幅度不完全一致，但整體下調表達趨勢一致，同樣，雖然的亮綠期轉錄組數據呈現略微上調但整體趨勢依然高度一致。綜上所述，選擇的6個基因在2種不同實驗方法中結果高度一致，能彼此驗證，表明了相關分析結果的可靠性。

圖4 YABBY蛋白家族系統進化分析

圖5 HbYABBY基因在橡膠樹不同組織中的表達分析

圖6 HbYABBYs在胚及葉片的不同發育時期基因表達分析

圖7 HbYABBYs在葉片高低溫處理下的表達分析

3 討論

3.1 植物YABBY功能重要，進化保守

作為一類植物特有的轉錄因子，在生長發育和非生物脅迫應答中起著重要的作用，但目前該轉錄因子在包括橡膠樹在內的具有重要經濟價值的大戟科植物中尚無相關研究和報道。橡膠樹全基因組測序完成[27]，使我們得以全面系統地發掘和研究在橡膠樹中的特征和功能。

本研究從全基因組水平鑒定得到11個橡膠樹HbYABBY基因家族成員，分布在9條染色體上，其中有5條染色體的該基因區段存在共線關系，揭示橡膠樹中該基因家族通過全基因組復制或大片段重復進行基因擴張。與模式植物擬南芥的AtYABBY蛋白序列比較分析發現該家族功能域蛋白序列高度相似，在基因結構上內含子數量均在5～6個之間，暗示了植物YABBY家族進化過程中保守，在植物中發揮相似的重要功能[26]。有意思的是，包括大戟科的木薯、蓖麻等植物YABBY的系統進化分析顯示，該家族分為4個亞組，橡膠樹YABBY成員分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分支，但在Ⅳ中缺失，其中亞組Ⅰ中成員多達5個，推測大戟科植物在物種分化后該基因家族在橡膠樹中發生了不同于其他植物的獨立進化。

3.2 YABBY在橡膠樹器官發育及高溫應答中發揮重要作用

轉錄因子通過與啟動子互作激活靶基因的表達從而發揮調控作用，利用轉錄組測序數據對HbYABBY基因家族的表達進行全面分析揭示它們在橡膠樹中的功能，結果表明HbYABBY基因家族具有很強的組織和時空表達特異性。其中在花中顯著高表達，其次在葉片中較高豐度表達，而在膠乳、根、樹皮和種子低表達或不表達，這與擬南芥YABBY基因家族在側生器官表達研究的結果一致[5]。、、等基因在花中高表達，其中和同時也在胚中相對高表達，并且在胚發育過程中也持續高豐度表達，表明它們參與了花器官及胚的形成和生長發育。葉片是HbYABBY除花之后次高表達的組織，并且基因家族在葉片發育過程中呈明顯下調表達，轉錄組測序和RT-qPCR均驗證了這一趨勢，表明該基因家族深度參與葉片的發育和形態建成。此外，溫度脅迫實驗顯示葉片中HbYABBY基因受高溫誘導下調表達但不受低溫誘導，暗示了HbYABBY基因對橡膠樹在熱帶地區生長抗高溫方面具有調控作用，但在抗寒中作用不明顯。橡膠樹11個HbYABBY家族成員中在所有樣品檢測中不表達，推測該基因可能在進化過程中發生去功能化或者具有其他特異表達特性。上述結果表明了橡膠樹HbYABBY家族成員在不同組織、不同發育時期以及高低溫處理葉片中的表達特性，反映了該基因家族的功能多樣性。

圖8 橡膠樹6個HbYABBYs基因在葉片發育過程中的熒光定量PCR和轉錄組分析比較

啟動子控制著基因轉錄的時間和轉錄表達的強度，作用因子通過與啟動子區的順式作用元件發生特異性互作來激活相關基因的轉錄達到調控基因表達的目的[28-29]。對11個HbYABBY基因家族的啟動子區域進行分析，發現光響應元件是所有成員都含有且數量最多的順式作用元件，這與轉錄組分析HbYABBY家族在橡膠樹葉片形態建成中具有非常重要的作用相一致。此外，植物激素應答元件在基因啟動子區的含量比較多，如脫落酸、厭氧誘導等，表明該基因家族參與了諸如干旱等非生物脅迫下代謝調節[30-31]。相對于擬南芥，基因在啟動子區的植物激素元件和非生物脅迫元件更多，意味著基因在調控橡膠樹逆境非生物脅迫應答中具有更重要的作用[31]。

本研究通過生信方法從全基因組水平對橡膠樹YABBY家族進行了成員鑒定，從染色體定位、基因結構、保守功能域、系統進化等進行了全面的分析，對組織、胚和葉片發育的不同時期以及高低溫處理葉片材料進行表達分析，并通過RT-qPCR做了進一步驗證，篩選出主要表達成員，初步預測了各成員基因的功能，為深入研究橡膠樹及植物的YABBY基因家族功能提供了理論基礎和參考依據。

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Identification and Expression Analysis of YABBY Gene Family in

ZHANG Hongtao1,2, XIAO Xiaohu2, YANG Jianghua2, QIN Yunxia2, LONG Xiangyu2, YIN Hongyan1, FANG Yongjun2*

1. College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China; 2. Institute of Rubber Research, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Haikou, Hainan 571101, China

YABBY genes family is a plant-specific transcription factor, which plays an important role in the development of plant leaves, floral organs and abiotic stress response, but it has not been reported in rubber tree so far. In this study, elevengenes were identified from the genome of, and the gene structure, promoter regulatory elements, chromosome location and collinearity, phylogeny and gene expression were analyzed. The results showed that thefamily genes were distributed on nine chromosomes. The length of the encoded protein was between 141 and 233 amino acids, and the molecular weight was ranged from 14.75 to 26.41kDa. The promoter regions contained response elements such as stress response, among which the number of light response elements was the largest. Gene transcriptional analysis showed thathad significant tissue-specific expression profile, eight genes were only highly expressed in leaves and flowers but not in latex and roots. During the leaf development, except for HbCRC1, the expression of the other 9were significantly down-regulated, which indicated thatwere deeply involved in the regulation of leaf development of rubber trees. Furthermore, both transcriptional and RT-qPCR experiments showed thatgenes were continuously down-regulated under high temperature treatment, indicating the regulatory roles in high temperature stress responses of rubber trees. In this paper,genes were firstly reported in, the physical and chemical characteristics, expressions and function of the genes were preliminarily studied, which would provide a solid foundation to investigate the functions and evolution ofgenes.

; YABBYgenes family; transcription factor; gene expression analysis

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.002

2022-06-07；

2022-07-14

國家自然科學基金面上項目（No. 31770711）；中國熱帶農業科學院橡膠所基本科研業務費項目（No. 1630022020023）；國家重點研發計劃項目（No. 2018YFD1000500）。

張鴻韜（1997—），男，碩士研究生，研究方向：橡膠樹產膠分子生物學。*通信作者（Corresponding author）：方永軍（FANG Yongjun），E-mail：fangyj@foxmail.com。