甘蔗鐮孢菌FsANT基因的克隆及表達模式分析

王彩霞，黃 振，李慧雪，周宇明，段真珍，暴怡雪，張木清*，姚 偉,3**

甘蔗鐮孢菌基因的克隆及表達模式分析

王彩霞1,2，黃 振1,3*，李慧雪1,2，周宇明1,2，段真珍1,3，暴怡雪1,3，張木清1,3**，姚 偉1,2,3**

1. 亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004；2. 廣西甘蔗生物學重點實驗室，廣西南寧 530004；3. 廣西大學農學院，廣西南寧 530004

甘蔗是我國主要的糖料作物，是生產蔗糖最主要的原料，甘蔗生產過程中受到的病蟲害威脅給蔗糖產業造成了嚴重的損失。甘蔗鐮孢菌（）引起的梢腐病是一種真菌性病害，嚴重影響甘蔗作物生產。鐮孢菌致病基因的研究對于梢腐病的防治具有重要意義。腺苷酸轉移酶（adenine nucleotide translocase, ANT）介導線粒體與細胞質基質之間ADP/ATP的交換，在真核細胞能量代謝中發揮重要作用，與細胞的生長、發育和凋亡密切相關。本研究克隆獲得了長936 bp具有完整開放閱讀框（open reading frame, ORF）的甘蔗鐮孢菌ANT基因序列，命名為，其編碼311個氨基酸，并且與小麥條銹菌病原菌ANT蛋白和小麥白粉病病原菌ANT序列相似性較高。蛋白軟件分析顯示，該基因編碼的蛋白為穩定的疏水蛋白，含有5個跨膜結構，一個ADP/ATP transporter結構域，有3個同源重復的MCF基序，與粒體轉運蛋白家族（mitochondrial carrier family，MCF）的基本結構特點相吻合。軟件預測分析發現基因可能定位在線粒體。qRT-PCR結果顯示，基因在菌絲生長時期的表達相對穩定無顯著差異；在與甘蔗互作過程的表達模式表現為：接種后12 h該基因開始上調表達，24 h表達量顯著升高，72 h達到表達高峰。推測基因的表達不僅與甘蔗鐮孢菌細胞的生長相關，同時可能參與與甘蔗的互作過程，且主要在侵染后期發揮功能。研究病原菌生長保守基因為甘蔗抗梢腐病育種提供新思路。

甘蔗梢腐病；甘蔗鐮孢菌；腺苷酸轉移酶；基因克隆；表達分析

甘蔗（spp.）不僅是我國最重要的糖料作物，還是關系國計民生的重要戰略物資，保障食糖安全已上升成為國家戰略[1-2]。廣西地區的亞熱帶氣候，適合甘蔗生長的同時也利于各種病害的發生與傳播，其中，梢腐病（pokkah boeng disease）是由真菌引起的主要威脅甘蔗梢部幼嫩葉片的病害，輕者使甘蔗梢部葉片褪綠，扭曲變形，嚴重時會使梢部整個畸形壞死，引起頂腐，甚至造成甘蔗整株死亡[3-4]。近年來甘蔗梢腐病的發病趨勢逐年加重，廣西作為我國最主要的甘蔗種植地區，其蔗區的梢腐病由以前的零星發生到現在已發展成為甘蔗生長前中期的主要病害。梢腐病的發生不僅出現在廣西蔗區，在云南蔗區也有發生，一些高感品種因梢腐病爆發致使甘蔗產量下降30.2%～48.5%，其發生逐漸表現出無規律性、無區域性的特點[5-7]。甘蔗梢腐病的發生導致甘蔗產量下降，影響甘蔗品質（如會引起甘蔗糖分、蔗汁錘度、蔗汁重力純度等降低）[4, 8]，對甘蔗生產以及蔗糖產業的可持續發展構成了嚴重威脅。甘蔗梢腐病病原菌為半知菌亞門鐮刀菌屬，我國甘蔗梢腐病病發的主要病原菌有等[9]。研究甘蔗鐮孢菌的能量代謝機制是甘蔗梢腐病防治的基礎性工作，對甘蔗梢腐病的防治具有重要意義。

線粒體轉運蛋白（mitochondrial carrier family, MCF）是位于線粒體膜上的跨膜蛋白，介導細胞質與線粒體之間的能量交換，將在線粒體中產生的多余的能量傳遞至細胞質中[10]。腺苷酸轉移酶（adenine nucleotide translocase, ANT），又稱ADP /ATP載體蛋白（ADP/ATP carrier protein, AAC）或ADP/ATP轉位酶（ADP/ATP translocase, AAT），是MCF家族的成員并且是含量最豐富的線粒體內膜蛋白[11, 10-13]。MCF motif中的RRRMMM氨基酸序列位于ANT轉運的重要位置，負責吸引ADP結合到ANT蛋白上，進而激發轉運的發生[10, 14-17]。ANT蛋白富含N-豆蔻酰化位點，N-豆蔻酰化修飾發生在多肽鏈N端的甘氨酸殘基上，賦予蛋白靈活可變的膜結合能力[18-19]。ANT介導ATP與ADP的跨線粒體膜交換，利用產電轉運機制，在底物濃度梯度和電子傳遞鏈產生的線粒體膜電位的驅動下[11, 20]，通過ANT載體2種狀態的循環實現ADP/ATP的交換，ANT載體的中心結合位點在線粒體基質開放狀態（matrix-open state）下結合ATP并轉運至細胞器膜內腔，在細胞質開放狀態（cytoplasmic-open state）下專一地與細胞器內等量的ADP分子結合并轉移到膜外釋放，完成ADP/ATP的轉運[13, 21-22]。由于ANT在氧化磷酸化及能量代謝中發揮著重要作用，已經在線蟲、哺乳動物、真菌等多種生物體中被廣泛研究[10]。除了介導ADP/ATP的轉運，在細胞凋亡調控網絡中ANT也發揮著重要作用[23]。作為線粒體凋亡途徑的關鍵步驟，線粒體外膜的通透化作用（mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）觸發凋亡因子（如細胞色素c等）的釋放，使其從線粒體膜間隙進入細胞質，在細胞質中，這些因子確保了凋亡級聯的傳播和細胞死亡的執行，但該機制仍存在爭議[24]。線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore compiex, mPTPC）的打開導致線粒體膨大和線粒體外膜破裂，被認為是哺乳動物MOMP發生的關鍵機制之一。雖然該孔的分子組成尚未完全確定，但有研究認為其主要成分是ANT、電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel, VDAC）和親環素D（cyclophilin D）[25-27]。ANT作為PTPC最主要的成分之一在介導細胞凋亡調控中具有重要貢獻[28]。

目前，已經在多種病原微生物中對ANT蛋白進行了功能初步探究。在小麥白粉病菌（）中，王俊美等[17]通過RCAE技術鑒定到1個保守的ANT蛋白BgtAACPx，該蛋白含有ANT蛋白的所有特征，并且該基因在侵染后48～ 72 h表達量顯著提升，推測該蛋白可能在形成吸器及菌絲過程中提供能量。在小麥條銹病菌（），TANG等[29]通過同源比對發現1個保守的PstANT蛋白，通過免疫膠體金發現該蛋白定位于真菌線粒體，其3個結構域對其功能具有重要意義，qRT-PCR顯示在侵染階段顯著上調表達，推測該蛋白可能與病原菌生長發育有關。綜上作為MCF家族成員的基因在病原菌能量代謝以及轉換途徑中發揮重要作用。本研究在課題組前期獲得的甘蔗鐮孢菌全基因組數據（未公布）的基礎上，通過生物信息學分析，鑒定得到一個腺苷酸轉移酶基因。qRT-PCR驗證發現基因的表達貫穿甘蔗鐮孢菌細胞的生命活動周期，可能與細胞生命活動中的能量供應相關，為進一步解析該基因在致病過程中的作用和制定甘蔗梢腐病防控措施提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及菌株 本研究以‘中蔗1號’為供試甘蔗品種，取蔗莖于溫室大棚（廣西大學）內桶栽，光周期為16∶8（光照∶黑暗），5葉展齊后用于接種實驗，該品種對表現為感病。供試菌株為本實驗室分離純化的甘蔗鐮孢菌（）菌株，于28℃恒溫下PDA/PDW培養基中生長。大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞（購自北京全式金生物技術股份有限公司）于37℃恒溫條件下LB培養基中生長。

1.1.2 試劑 高純度DNA純化回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自天根生物技術（北京）有限公司；TB Green?Premix Ex Taq? II、pMD?18-T Vector Cloning Kit購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 蛋白質的理化性質由在線工具ExPASy-Proparam（https://web.expasy.org/ protparam/）分析得到。蛋白質的跨膜區通過在線工具TMHMM Server 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）以及TMPRED（http://www. ch.embnet.org/software/TMPRED form.html/）進行分析。蛋白質的保守結構域通過在線工具Conserved Domain Search（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/）預測分析。蛋白的功能位點由在線工具Scanprosite（https://prosite.expasy.org/scanprosite/ scanprosite_doc.html）預測分析。亞細胞定位由在線工具Euk-mPLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/euk-multi-2/）預測分析。利用BLAST比對分析軟件對克隆目的片段進行同源性分析，利用DNAMAN軟件進行多序列比對分析。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA合成 甘蔗鐮孢菌（）于PDA平板上28℃恒溫培養72、144、216 h后，提取菌絲RNA。接種甘蔗后，分別于0、12、24、72、120、168 h采集甘蔗葉片，參照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取總RNA，紫外分光光度計檢測樣品RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品RNA的完整性。利用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，反應體系和反應程序參照試劑盒（TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）說明書。

1.2.3 目的基因克隆 利用在線工具Primer- BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer- blast/）設計基因的特異性引物F/R（表1），以菌絲cDNA為模板，用高保真酶（2× Phanta?Max Master Mix）進行PCR擴增，反應體系（50 μL）為：

2×Phanta Max Master Mix25 μL Forward Primer (10 μmol/L)1 μL Reverse Primer (10 μmol/L)1 μL cDNA1–5 μL ddH2Oup to 50 μL

PCR反應程序參照2×Phanta?Max Master Mix說明書。反應結束后瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，利用DNA純化回收試劑盒純化回收目的基因后，利用DNA A-Tailing Kit（TaKaRa）在DNA片段的3￠末端加“A”尾，連接至pMD18-T Vector克隆載體（TaKaRa），轉化至大腸桿菌Trans1-T1，挑取陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4 目的基因的表達模式分析 使用LightCycler 96定量PCR儀器進行反應，以反轉錄得到的cDNA為模板，在Primer-BLAST （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）上進行qRT-PCR引物的設計（表1），選取核糖體18s基因作為內參基因。利用TB Gree（TaKaRa）染料法進行PCR擴增，每個反應設3個生物學重復。反應結束后，按照2–??CT法[30]分析基因在菌絲生長時期以及侵染甘蔗時期的相對表達量。用GraphPad Prism軟件進行繪圖。

表1 本研究所用引物

2 結果與分析

2.1 FsANT序列分析及同源比對

根據前期測得的甘蔗鐮孢菌（）基因組，通過BlastP軟件分析得到了一個腺苷酸轉移酶蛋白序列，基因的ORF框長度為936 bp，編碼311個氨基酸。利用NCBI Conserved domian search軟件對其保守結構域進行分析，結果顯示，FsANT基因編碼的氨基酸序列含有1個保守的ADP/ATP transproter結構域（圖1）。小麥白粉菌[17]和小麥條銹菌[29]中的ANT蛋白已經報道，下載其蛋白序列。通過軟件的比對分析，發現FsANT與已經報道的BgtAACPx，PstANT同源性較高，并且含有相似的結構域（Repeat 1、Repeat 2和Repeat 3）。說明該基因編碼的蛋白可能是一個ANT蛋白（圖2）。

圖1 FsANT保守結構域

圖2 FsANT與已知ANT蛋白的多序列比對

2.2 目的基因的克隆

根據已經獲得的甘蔗鐮孢菌基因ORF設計基因特異性引物-F/R（表1），以菌絲cDNA為模板，進行目的基因克隆。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測得到長度約936 bp大小的條帶（圖3），克隆測序獲得序列與基因組測序結果一致（圖4）。

2.3 FsANT生物信息學分析

通過ExPASy-Proparam軟件分析其理化性質（表2），其編碼蛋白分子量為33 761.390 Da，理論pI值為9.890，親水性平均系數為0.031，被歸類為疏水性蛋白。不穩定系數為24.800（小于40），為穩定蛋白。利用TMHMM和TMPRED軟件分析表明（圖5），FsANT蛋白含有5個跨膜結構，分別為9～34，116～141，180～204，216～241，280～307位氨基酸，屬于跨膜蛋白。Scanprosite分析結果表明ANT蛋白含有3種功能位點，其中3個蛋白激酶C磷酸化位點、3個酪蛋白激酶II磷酸化位點和14個N-豆蔻酰化位點（表3）。其中富含N-豆蔻酰化位點作為ANT蛋白的一個重要特征，說明FsANT可能是一個保守的功能蛋白。利用Euk-mPLoc 2.0軟件進行亞細胞定位分析，預測結果表明ANT蛋白亞細胞定位于線粒體。

圖3 FsANT基因ORF的PCR擴增產物

圖4 FsANT基因測序結果

表 2 FsANT蛋白的基本理化性質

圖5 FsANT跨膜結構分析

表3 FsANT蛋白的功能位點

ANT的一級結構顯示該蛋白有3個重復的同源區域，在每個重復區域都可以找到1個共同的MCF基序（圖6），即PxD/ExxK/RxK/R-（20～30個氨基酸殘基）-D/EGxxxxaK/RG（其中字母a表示芳香族殘基）。Repeat 1、Repeat 2和Repeat 3與已報道的基序基本相同，其中只有單個氨基酸的突變，可能與物種差異性有關。同時Repeat 3出現了RRRMMM序列，這是所有屬于MCF的ANT載體蛋白都具有的特征。

2.4 FsANT表達模式分析

通過qRT-PCR分析基因的表達模式，菌絲時期以在PDA平板生長72 h的表達量作為對照（CK，設相對表達量為1）；侵染時期以在菌絲時期的表達量作為對照（CK，設相對表達量為1），GraphPad Prism軟件繪制表達模式圖。基因在生長的各個時期均有表達且表達無顯著差異（圖7A）。基因的表達貫穿于侵染甘蔗的整個時期，接種后12 h該基因開始上調表達，24 h表達量顯著升高，72 h達到表達高峰，與在菌絲體的表達量存在極顯著差異，約為菌絲表達量的2.6倍，72 h后表達量開始下降（圖7B）。根據先前的研究基礎，甘蔗鐮孢菌在侵染甘蔗24 h后，分生孢子長出芽管，伸入植物氣孔或毛狀體；侵染后72 h，菌絲加快生長，從氣孔伸出，纏繞毛狀體進一步向周邊擴散[31]。這表明基因在甘蔗鐮孢菌在甘蔗表面定殖及擴散過程中發揮了重要功能，推測可能主要參與能量代謝。

圖6 FsANT的3個MCF基序

ns表示差異不顯著（P>0.05），*表示差異顯著（P<0.05），**表示差異極顯著（P<0.01）。

3 討論

近年來，隨著我國蔗區甘蔗梢腐病的普遍發生，病原菌變異速度較快，所以控制病原菌的危害是一類重要難題。以病原菌生長保守基因為切入點，通過抑制病原菌的繁殖來提高品種抗性，也是一種經濟有效的手段。ANT蛋白作為重要的能量轉換蛋白，可以轉運ADP/ATP，并且可以調控細胞凋亡。PEREIRA等[28]和ZHIVOTOVSKY等[32]發現ANT參與酵母、線蟲及哺乳動物的細胞凋亡過程。王俊美等[17]發現基因的表達可能和白粉菌與小麥互作時所需的能量提供有關；TANG等[29]的研究表明基因可能參與小麥條銹菌細胞的能量供應以及細胞凋亡調控過程。本研究從甘蔗梢腐病病原菌中克隆得到了一個936 bp的基因，該基因編碼311個氨基酸，含有ADP/ATP transporter結構域，通過DNAMAN多序列比對分析，發現該蛋白與已知的ANT蛋白（PsANT[29], BgtAACPx[17]）結構域特征高度相似，推測FsANT蛋白可能與PsANT, BgtAACPx等已報道的ANT蛋白具有類似的功能。

本研究得到的ANT蛋白符合MCF成員的一般特征，通過與已報道的文獻相比較[10]，ANT蛋白重復表達了“PxD/ExxK/RxK/R-(20～30個殘基)- D/EGxxxxa（芳香族氨基酸殘基）K/RG”基序，Repeat 1和Repeat 2中出現個別氨基酸的突變，這可能與物種差異性有關；位于ANT轉運重要位置的“RRRMMM”序列在Repeat 3中檢測到，表明該ANT蛋白可能具有轉運ADP/ATP的一般特性。FsANT蛋白定位在線粒體上，這與ANT蛋白在線粒體中發揮功能的特性相一致。在菌絲生長各個時期的表達無顯著差異，表達相對穩定，推測該基因可能參與甘蔗鐮孢菌細胞整個生長的能量供應；同時該基因在侵染時期上調表達，接種后24 h表達量顯著升高，72 h達到表達高峰，與在菌絲體的表達量存在極顯著差異。基因的表達模式在其他文獻中也有報道，小麥白粉菌基因在侵染72 h表達量最高[17]；小麥條銹菌基因在接種后24 h呈現上調表達，接種48 h以及120 h為2個表達高峰期[29]。由此可見，這類基因的表達模式基本相同，表達貫穿病原菌與寄主互作的整個時期，但是主要在侵染后期發揮功能。通過比較病原菌侵染過程的顯微觀察結果，說明該基因參與分生孢子到芽管的萌發，并且在菌絲定殖甘蔗和擴散中發揮重要功能，推測該基因為病原菌侵染過程提供能量。綜上，基因在甘蔗鐮孢菌生長的各個時期以及侵染甘蔗過程中均發揮了重要功能，可能與細胞生命活動中的能量供應相關。下一步將通過真菌基因敲除，顯微觀察，致病力鑒定等進一步探究該基因的功能，并通過HIGS技術討論該基因對于抗病種質材料創制的意義。

綜上，本研究克隆得到了甘蔗鐮孢菌的一個腺苷酸轉位酶基因，推測該基因可能參與甘蔗鐮孢菌的能量代謝。但是，對基因參與能量代謝的機制，還需要進一步研究。

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Cloning of anGene inand Analysis on Its Expression Pattern During Infection Process

WANG Caixia1,2, HUANG Zhen1,3*, LI Huixue1,2, ZHOU Yuming1,2, DUAN Zhenzhen1,3, BAO Yixue1,3, ZHANG Muqing1,3**, YAO Wei1,2,3**

1. State Key Lab of Conservation and Utilization of Agric-Biological Resources, Nanning, Guangxi 530004, China; 2. Guangxi Key Lab of Sugarcane Biology, Nanning, Guangxi 530004, China; 3. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China

Sugarcane is the main sugar crop in China and the most important raw material for sugar production. The threat of diseases and insect pests in sugarcane production has caused serious losses to the sugar industry. Tip rot caused byis a fungal disease that seriously affects sugarcane crop production. It is of great significance to study the pathogenic genes of. Adenine nucleotide translocase (ANT) mediates the exchange of ADP/ATP between mitochondria and cytoplasmic matrix, which plays an important role in eukaryotic cell energy metabolism and is closely related to cell growth, development and apoptosis. In this study, a 936 bp ANT gene sequence ofwith a complete open reading frame (ORF) was cloned, tentatively named, encoding 311 amino acids.protein ofwas found to cluster with ANT protein of other pathogens, indicating thatmay had the similar function. Softwares analysis showed that the protein encoded by this gene was a stable hydrophobic protein, containing five transmembrane structures. In addition, ANT has three homologous and repeated MCF motifs in one ADP/ATP transporter domain, which conforms to the basic structural characteristics of Mitochondrial carrier family (MCF). The software predicted that the gene might target mitochondria. qRT-PCR results showed thatgene expression was relatively stable during mycelia growth period without significant difference. In the process of interaction with sugarcane, the expression pattern of this gene began to be up-regulated 12 h after inoculation, and increased significantly 24 h after inoculation, and reached its peak at 72 h. It is speculated that the expression ofgene was not only related to the growth ofcells, but also maight participate in the interaction betweenand sugarcane, and mainly played a role in the later stage of infection. The study of pathogenic growth conserved genes would provide a new idea for sugarcane breeding against pokkah boeng disease.

sugarcane pokkah boeng disease;; adenine nucleotide translocase (ANT); gene clone; expression analysis

S435.661

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.007

2022-01-25；

2022-03-21

廣西重點研發計劃項目（桂科AB21238008）；國家自然科學基金項目（No. 32001603）；國家現代農業糖料產業技術體系項目（No. CARS-170726）。

王彩霞（1998—），女，碩士研究生，研究方向：甘蔗遺傳育種；*同等貢獻作者：黃 振（1994—），男，博士研究生，研究方向：甘蔗遺傳育種。**通信作者（Corresponding author）：姚 偉（YAO Wei），E-mail：yaoweimail@163.com；張木清（ZHANG Muqing），E-mail：zmuqng@163.com。