桑樹MaUBC-C基因的表達模式分析及原核表達

趙鑫茹，莫映熙，李界秋，蒙姣榮*

桑樹基因的表達模式分析及原核表達

趙鑫茹1，莫映熙1，李界秋2，蒙姣榮1*

1. 廣西大學農學院，廣西南寧 530005；2. 廣西大學農牧產業發展研究院，廣西南寧 530005

泛素結合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）在植物中具有重要的作用，參與植物的生長發育、逆境脅迫、免疫響應等生理活動。本課題組前期通過分析桑脈帶相關病毒（, MVBaV）侵染的桑樹品種‘桂桑優62號’（）轉錄組獲得了上調表達的基因。為探究泛素結合酶基因的功能，本研究以‘桂桑優62號’桑樹為材料，克隆的CDS序列進行生物信息學和表達模式分析，并對其進行原核表達獲得該蛋白。結果顯示，編碼區全長為567 bp，編碼蛋白含188個氨基酸，大小為21.03 kDa，屬于親水、酸性、不穩定的核定位蛋白，具有保守的UBC結構域。將其氨基酸序列與其他物種的UBC氨基酸序列進行比對和進化分析，發現MaUBCC與川桑MnUBCC的相似性最高為98.40%，且具有最近的進化親緣關系。熒光定量PCR分析基因表達模式，結果顯示在桑苗的根、莖、葉中均有表達，其中在根部表達量最高，分別是莖和葉的1.24倍和1.71倍；對外源激素（ABA、GA、MeJA、SA）和非生物脅迫（低溫、高溫、高鹽、干旱）處理均產生響應，且在ABA和MeJA處理下表現出顯著上調，在24 h時的表達量分別為正常水平的29.55、9.05倍，推測在桑樹的生長發育中具有廣泛的調控作用，參與桑樹的激素信號轉導和對非生物脅迫的防御反應。利用無縫克隆技術構建原核表達載體pET-30a-并轉化大腸桿菌BL21，0.5 mmol/L IPTG在37℃條件下進行誘導，獲得約為25 kDa的融合蛋白，與預期大小相符，為今后進行基因功能研究提供了基礎材料。本研究為進一步探究桑樹泛素蛋白酶體途徑的作用機制奠定了基礎。

桑樹；泛素結合酶；表達模式；原核表達

泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是植物體內功能最廣泛的細胞信號系統，它既可以去除大部分異常和短壽命的多肽和蛋白質，也可以調節它們的活性，以維持植物的正常生長[1]。該系統由泛素（ubiquitin, Ub）、泛素活化酶E1（ubiquitin-activating enzyme, UBA）、泛素結合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）、泛素連接酶E3（ubiquitin-ligase）、26S蛋白酶體（proteasome）組成[2]。泛素結合酶E2在這個系統中具有“橋梁”的作用，它在E3的協助下，接受被E1活化的泛素，并將其轉移到靶蛋白上[3]。E2大小不等，但每個E2都有140～200個氨基酸形成的UBC保守結構域，根據UBC的兩端是否有延伸將分為4類，只有UBC結構域的E2為第Ⅰ類，不僅含有UBC結構域且N端有延伸的為第Ⅱ類，C端有延伸的為第Ⅲ類，兩端都有延伸的為第Ⅳ類[4]。

泛素結合酶E2已經被證實參與植物的許多生理反應，與植物的生長發育息息相關。CUI等[5]研究擬南芥的得出該基因受到氧化脅迫的誘導，參與植物的氧化脅迫反應。擬南芥中的被證實除參與植物生長發育外，還與其生物脅迫響應有關。WANG等[6-7]通過對比擬南芥突變體和野生型發現影響著雌配子體的形成，后續又發現影響擬南芥的形態，且突變體一定程度上提高了擬南芥對灰霉病菌的抗性。大豆泛素結合酶在擬南芥中異源表達可提高種子的重量和氨基酸的含量[8]。李興涵等[9]利用RNAi技術降低萊茵衣藻泛素結合酶的表達量獲得轉基因藻株發現泛素結合酶參與缺氮、缺磷脅迫響應，正向調控油脂積累。沉默煙草中馬鈴薯的同源基因后可降低煙草對晚疫病菌的抗性[10]。DIAO等[11]對荷花進行非生物脅迫和外源激素處理后發現表達量都有顯著變化，表明可能參與荷花的非生物脅迫和激素調節。

桑樹（spp.）具有很高的經濟價值，桑葉、桑木可作藥材，桑葉可作蠶的飼料，桑葚可以直接食用也可加工制成其他食品，并且桑樹本身還具有很高的環保效益。川桑（）基因組測序的工作已經完成[12]，但目前關于桑樹中泛素結合酶E2的研究和報道較少。前期研究中，我們對桑脈帶相關病毒（, MVBaV）侵染的桑樹品種‘桂桑優62’（）轉錄組進行分析，獲得上調表達基因。本研究從‘桂桑優62’克隆了，對其進行了生物信息學分析，并利用qRT-PCR研究其不同組織中和在外源激素、非生物脅迫下的表達情況，分析在桑樹中的作用，通過原核表達獲得該蛋白，以期為泛素蛋白酶體途徑在桑樹中的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為桑樹‘桂桑優62號’，種植于溫度25℃、濕度70%的人工氣候培養室。總RNA提取試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司，高保真酶PrimeSTAR?HS（Premix）購自TaKaRa公司，反轉錄試劑盒HiScript?II Q RT Super Mix for qPCR（+gDNA wiper）、質粒提取試劑盒、產物純化試劑盒、熒光定量PCR試劑盒ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix、普通PCR酶2 × RapidMaster Mix均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，克隆試劑盒pEASY- Blunt Zero Cloning Kit和pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit、PVDF膜購于北京全式金生物技術有限公司，小鼠抗His-Tag單克隆抗體購于百遠生物公司，山羊抗小鼠IgG抗體購于碧云天生物公司，引物合成于擎科梓熙生物科技有限公司，測序工作由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 桑幼苗種植管理及處理 將桑苗培養至6～7葉期，選取長勢一致的桑苗進行外源激素和非生物脅迫處理。外源激素處理：用100 μmol/L水楊酸（salicylic acid, SA）、赤霉素（gibberellin, GA）、脫落酸（abscisic acid, ABA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）對桑苗葉片進行噴灑至飽和。非生物脅迫處理：將桑苗置于4、42℃光照培養箱設為低溫和高溫處理；將桑苗根部浸泡于10% PEG 6000溶液和100 mmol/L NaCl溶液，設為干旱和高鹽處理。分別于每種處理后的0、1、6、12、24 h時采集葉片，提取總RNA，用于后續基因在外源激素和非生物脅迫處理下表達模式的分析。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成 根據天根公司總RNA提取試劑盒的說明書提取健康桑葉和MVBaV侵染桑葉、桑苗的不同組織（根、莖、葉）和不同處理下桑葉或桑根的總RNA。通過超微量核酸蛋白分析儀和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和純度。根據南京諾唯贊公司反轉錄試劑盒的說明書對桑樹總RNA進行反轉錄，每個反應加入總RNA 500 ng，最終體系為20 μL，最后獲得cDNA，–20℃保存備用。

1.2.3基因編碼區的克隆根據實驗室前期獲得的桑樹轉錄組數據，設計克隆編碼區的特異性引物（表1）。以6～7葉期桑苗葉片總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，利用PCR擴增的ORF序列，反應體系：高保真酶25.0 μL，上游引物-F和下游引物-R（0.01 mol/L）各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 19.0 μL，共50.0 μL。將獲得的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用膠回收試劑盒將其純化回收，按目的基因與載體片段7∶1的摩爾比例，將目的基因連接到-Blunt Zero載體上，使用化學轉化法將連接產物轉到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，在含Kan抗性的培養基上培養20～24 h，挑取單菌落進行PCR檢測，選取陽性克隆進行測序。

表1 本研究所用引物

1.2.4 生物信息學分析 利用SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件分析MaUBC-C的結構域，Plant-mPLoc（http://www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預測其亞細胞定位情況。通過ProtParam （https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件分析MaUBC-C蛋白的理化性質，ExPaSy-SOPMA （https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https: //swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件預測MaUBC-C蛋白二級、三級結構。SignalP-5.0 Serve r（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、TMHM M Server v. 2.0（http://www. cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）、Protscale（https://web. expasy.org/ protscale/）在線軟件分析蛋白疏水性N端信號肽，預測蛋白的跨膜和疏水情況。在NCBI上進行MaUBC-C進行氨基酸序列比對，獲得MaUBC-C同源蛋白序列。使用DNAMAN對序列進行比對，再通過MEGA 7軟件中的鄰接法構建系統進化樹。

1.2.5 實時熒光定量PCR 根據的ORF序列設計實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR）的特異性引物（表1），選用桑樹α-tubulin作為內參基因（表1），采用SYBR Green法進行qRT-PCR擴增。反應體系：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1.0 μL，上、下游引物（0.01 mol/L）各0.4 μL，ddH2O 8.2 μL，共20.0 μL。擴增時，選擇3步法：95℃ 10 s，4.4℃/s；60℃ 15 s，2.2℃/s，72℃ 10 s，4.4℃/s，采集方式為Single，循環45次。每種處理設3個生物學重復，每個生物學重復再設3個技術學重復。利用2–ΔΔCT法計算出在MVBaV侵染桑葉、桑苗不同組織和不同處理條件下0、1、6、12、24 h表達量。

1.2.6原核表達載體的構建 以克隆質粒-Blunt Zero-為模板，設計帶有原核表達載體pET-30α接頭的引物（表1），進行PCR擴增獲得。利用限制性內切酶HⅠ、dⅢ酶切獲得線性pET-30a。根據全式金無縫克隆試劑盒的說明書進行操作，將目的基因與線性載體進行連接，轉入大腸桿菌BL21，并進行菌落PCR、酶切鑒定和測序。

1.2.7的誘導和免疫印跡分析 將過夜培養的菌液擴大50倍培養，以37℃、200 r/min條件繼續培養，當600為0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，開始進行誘導，誘導條件為37℃、200 r/min。在誘導時間1、2、3、4、5、6 h時收集菌液2.0 mL，離心后用1.0 mL pH為7.4的無菌PBS洗滌3次。最后加入500 μL PBS溶解，利用SDS-PAGE凝膠電泳檢測表達情況。為進一步驗證蛋白的表達情況，將誘導蛋白通過半干轉的方式轉印到PVDF膜上，用小鼠抗His單克隆抗體為一抗、山羊抗小鼠IgG抗體為二抗進行Western blot驗證。

2 結果與分析

2.1 MaUBC-C基因的序列分析

以提取桑樹葉片總RNA反轉錄的cDNA為模板，-F/R為引物擴增獲得的開放閱讀框架（ORF）序列，測序結果顯示ORF長為567 bp，預測編碼含188個氨基酸的蛋白。通過NCBI對的核酸序列進行比對分析，發現與川桑的核酸序列高度一致，為98.40%；通過SMART在線網站對MaUBC-C氨基酸序列進行分析，結果顯示MaUBC-C含有1個保守的UBC結構域，且兩端有延伸，屬于第Ⅳ類E2結合酶（圖1A），因此將候選基因命名為（GenBank號為：OL982612）。

ProtParam在線軟件分析MaUBC-C氨基酸序列得出，MaUBC C蛋白分子式為C935H1441N243O289S10，分子量大小為21.03 kDa，等電點為5.07，親水性為-0.441，脂肪指數為70.05，不穩定指數64.12，為酸性不穩定蛋白。ExPaSy- SOPMA預測MaUBC-C蛋白的二級結構，結果顯示MaUBC-C蛋白含有34.57%的α-螺旋結構、16.49%的延伸連結構、1.60%的β-轉角結構、47.34%的無規則卷曲結構（圖1B）。利用SWISS- MODEL預測得出MaUBC-C蛋白的三級結構，顯示其與人類的泛素結合酶UBCH10具有很高的相似性（圖1C）。通過SignalP分析顯示，MaUBC-C并不包含信號肽，表明MaUBC-C不屬于分泌型蛋白。TMHMM、Protscale分析得出其是一個不含跨膜結構的親水蛋白。Plant-mPLoc預測MaUBC-C定位在細胞核。

紅色：延伸鏈結構；紫色：無規則卷曲結構；藍色：α-螺旋結構；綠色：β-轉角結構。

2.2 MaUBC-C蛋白同源性和系統發育分析

利用NCBI數據庫中的BLASTp對MaUBC-C氨基酸序列進行同源性分析，發現MaUBC-C與川桑（）、核桃（）、楊梅（）、大麻（）、棗樹（）、梨（×、蘋果（）、桃（）、山黃麻（）、月季（）等多種高等植物的E2蛋白高度同源，其氨基酸序列與MaUBC-C的一致性為84.46%以上，其中與川桑MnUBC-C一致性最高為98.40%，其他依次是山黃麻ToUBC-C（91.10%）、大麻CsUBC-C（88.02%）、桃PpUBC-C（86.91%）、月季RcUBC-C（86.70%）、梨PbUBC- C（86.39%）、蘋果MdUBC-C（85.86%）、棗樹ZjUBC-C（85.86%），與核桃JrUBC-C、楊梅MrUBC19的一致性最低，均為84.46%（圖2）。將這些序列共同導入DNAMAN軟件進行比對，結果顯示這11個物種的泛素結合酶都含有UBC保守結構域，這表明E2蛋白在進化過程中比較保守。

紅色劃線部分為UBC保守結構域。

利用MEGA 7軟件構建這11個蛋白的系統進化樹。結果顯示，系統進化樹可分為兩大支，梨PbUBC-C、蘋果MdUBC-C、桃PpUBC-C、月季RcUBC-C、棗樹ZjUBC-C、核桃JrUBC-C、楊梅MrUBC19聚為一支，大麻CsUBC-C、山黃麻ToUBC-C、川桑MaUBC-C聚為一支。MaUBC-C與大麻CsUBC-C、山黃麻ToUBC-C、川桑MnUBC-C的親緣性更近；MaUBC-C和川桑MnUBC-C單獨聚為一小支，MaUBC-C和川桑MnUBC-C的親緣關系最近（圖3）。

2.3 MaUBC-C的表達模式分析

2.3.1的組織表達分析 以提取6～7葉期桑苗根、莖、葉的總RNA反轉錄獲得的cDNA為模板，利用qPCR檢測在不同組織的表達情況。結果如圖4所示，在根、莖、葉組織中均有表達，在根部的表達量最高，是莖、葉的1.24、1.71倍。

2.3.2 MVBaV侵染對表達的影響 以健康桑葉為對照，利用qPCR檢測MVBaV侵染桑葉的表達量，結果顯示，在MVBaV侵染的桑葉種的表達量顯著上調，為健康葉片的4.26倍（圖5），與本課題組前期對健康桑樹轉錄組和MVBaV侵染桑樹的轉錄組分析結果一致。

圖3 MaUBC-C蛋白與其他植物E2蛋白系統進化樹分析

*表示處理間差異顯著（P<0.05）。

2.3.3 外源激素處理下的表達量分析 對6～7葉期桑苗進行外源激素（SA、GA、ABA、MeJA）處理，通過熒光定量PCR檢測其表達量。結果顯示，的表達量在不同外源激素的處理后呈現出不同的響應模式。在ABA處理后，的表達量整體呈現上調的表達模式，1 h時表達量高于正常水平，為0 h的3.06倍，隨著ABA處理時間的增長，表達量不斷增高，在24 h表達量到達最大值，為正常水平的29.55倍。在GA處理的1 h時，表達量下降為0 h的0.45倍，而隨著時間的延長，表達量與0 h時相比變化并不顯著，6、12、24 h時表達量分別為0 h的1.17、1.00、0.82倍。在MeJA處理后，表達量變化趨勢與ABA處理后相同，整體呈現出上升的趨勢，在24 h時表達量最高，為對照的9.05倍。在SA處理后，1 h時表達量降低，為正常水平的0.66倍，6 h時表達量與1 h相比并無顯著差異，為正常水平的0.68倍，12 h時，表達量上調到正常水平的2.19倍，24 h時表達量略有下降，為0 h的1.91倍。以上表明可能參與桑樹的激素信號傳導途徑（圖6）。

**表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

*表示處理間差異顯著（P<0.05）；**表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

2.3.4 非生物脅迫下的表達量分析將6～7葉期的桑苗分別進行低溫、高溫、高鹽、干旱非生物脅迫處理，通過熒光定量PCR分析在不同非生物脅迫下的表達情況。在低溫處理下，整體呈現下調的趨勢，在1、6、12、24 h的表達量均低于正常水平，1 h時表達量為0 h的0.62倍，隨后表達量開始逐漸降低，于12 h降到最低值，為0.04倍，24 h時表達量略有回升，但還是顯著低于正常水平，為0.21倍。在高溫處理下，的表達量呈現“降-升-降-升”的趨勢，1 h時表達量下降，為正常水平為0.47倍，6 h時表達量接近正常水平，12 h時表達量又表現出下調模式為0.46倍，24 h時為0.65倍。在高鹽處理下，在1、12、24 h的表達量與0 h相比并無顯著差異，只有6 h時表達量與0 h的表達量差異顯著，為正常水平的2.76倍。在干旱處理下，的表達量呈現“降-升-降”的趨勢，1 h時表達量下降到正常水平以下，但無顯著差異，6 h時開始上調，12 h時到達最大值為2.94倍，24 h時的表達量開始下降，為1.53倍（圖7）。由此推測與桑樹的非生物脅迫響應有關。

*表示處理間差異顯著（P<0.05）；**表示處理間差異極顯著（P<0.01）。

2.4 MaUBC-C的原核表達

以克隆質粒為模板，帶有pET-30a載體接頭的引物pET-30a--F、pET-30a--R為模板，擴增獲得。利用無縫克隆技術將和pET-30a進行連接，轉化到大腸桿菌DH5α中。經菌落PCR和HⅠ、dⅢ雙酶切鑒定（圖8），將驗證正確重組質粒進行測序。測序結果顯示插入片段序列與ORF序列完全一致，表明原核表達載體pET-30a-構建成功。

M: GeneRuler 1 kb plus DNA Ladder; 1: MaUBC-C. 2: pET-30a-MaUBC-C; 3: Double enzyme digestion of pET-30a-MaUBC-C by BamHⅠ andHindⅢ.

用0.5 mmol/L的IPTG在37℃條件下對重組菌株進行誘導，誘導時間分別為1、2、3、4、5、6 h。對獲得的總蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測和免疫印跡分析，SDS-PAGE電泳結果顯示，與對照相比，誘導菌株出現一條大小25 kDa左右的條帶，大小與預期基本相符（圖9A），利用His-Tag抗體對重組菌株進行Western blot檢測，結果顯示重組菌株出現與一條大小與SDS-PAGE檢測結果相同的特異性條帶，只含pET-30a的大腸桿菌（對照）并沒有條帶出現（圖9B），原核表達成功。

圖9 MaUBC-C誘導情況驗證

3 討論

泛素結合酶E2在植物體內發揮著重要的作用，與植物的光形態建成、非生物脅迫、免疫響應等生理活動有關[12]。目前，已有多種植物的E2全基因家族被鑒定出來，擬南芥、土豆、番茄、香蕉中分別有37、57、59、74個E2[13-16]。本研究從桑樹品種‘桂桑優62號’克隆獲得了1個基因，命名為。該基因編碼的MaUBC-C蛋白與同為桑屬的川桑MnUBC-C蛋白具有98.40%的相似度和較近的親緣性，這表明E2蛋白在進化過程中高度保守。

已有多個研究表明基因在多種植物中具有組織特異性。在高粱中，有8個SbUBC基因在葉片或種子表達量是其他組織中的30倍以上，表明這些基因可能參與了葉片或種子的發育[17]；檢測在葡萄中的表達情況發現，和分別在衰老的葉片和冬芽中表達量較高，推測和可能與葡萄的落葉期和休眠期的生理活動有關[18]；玉米中的在不同的組織中具有不同的表達模式，說明基因在玉米發育過程中起著多方面的作用[19]。本研究利用熒光定量PCR分析了在桑苗中不同組織中（根、莖、葉）的表達模式，結果顯示在根、莖、葉中均有表達，且在根中的表達量最高，推測可能在桑樹的根中具有關鍵的調控作用。

泛素結合酶E2與植物的免疫防御息息相關，參與植物對病毒的應答過程。CHEN等[20]通過分析感染黃瓜花葉病毒（, CMV）黃金百香果的轉錄組得到了43個表達量發生變化的泛素化相關基因，其中包括2個基因。EINI等[21]驗證出木爾坦棉花曲葉病毒（, CLCuMV）中的βC1和番茄SlUBC3蛋白可以發生相互作用，且βC1轉基因煙草中的多泛素化蛋白水平會增加，推測βC1與SlUBC3的互作影響CLCuMV侵染植株的過程。IMURA等[22]證明了擬南芥AtUbc2p蛋白與番茄叢矮病毒（, TBSV）中的復制蛋白P33互作，AtUbc2p可以提高TBSV的復制能力。本研究驗證了桑脈帶相關病毒MVBaV可以影響基因的表達，證明基因與MVBaV侵染桑樹有關。但該基因在MVBaV侵染桑樹的過程中的作用機制尚不清楚。本課題組將研究MaUBC-C的互作蛋白，從而進一步明確基因在桑樹免疫中的功能。

大量研究表明參與植物的激素信號傳導、非生物脅迫調節。用SA、MeJA處理龍眼發現出現了不同程度的表達量上調或下調，表明泛素結合酶與龍眼的激素響應通路有關[23]；AHN等[24]通過對擬南芥的、、單突變株和三突變株進行ABA和干旱處理，氣孔關閉程度和萎蔫情況顯示突變株對ABA和干旱處理更為敏感，這說明、和在干旱脅迫響應中起著負反饋調節的作用；SUN等[25]獲得了擬南芥、突變株后對其進行了高鹽處理，結果表明、突變株表現出高鹽逆境的不耐受，他們又對和回補株進行了高鹽逆境鑒定，結果顯示回補株與野生型并無差異，這證實了、與擬南芥的干旱調節有關；陳曙等[26]對玉米進行低氮處理發現被檢測的8個基因的表達量發生了變化，推測玉米泛素結合酶可能參與了玉米對低氮脅迫響應過程。在外源激素（ABA、GA、MeJA、SA）、非生物脅迫（低溫、高溫、高鹽、干旱）的處理下，表達量產生了不同程度的變化，推測在桑樹的激素信號調節和逆境脅迫中具有重要作用。

已有研究表明，ABA、MeJA與植物對病毒的抗性有關。ALAZEM等[27]證明ABA通過調節2、3的表達來提高植株對竹花葉病毒（, BaMV）的抗性；大豆中的抗性基因可以誘導ABA的合成，從而提高對大豆花葉病毒（, SMV）無毒株系G5H的抗性[28]；MeJA通過提高細胞膜的穩定性、激活一系列的抗氧化酶、誘導抗性基因的表達來增強黑綠豆對印度綠豆黃花葉病毒（, MYMIV）的抗性[29]。本研究已經證明MVbaV、ABA、MeJA可以誘導基因的表達，推測基因可能在ABA、MeJA誘導的對病毒的抗性中起到一定的作用，但具體作用機制尚不可知。另外，植物的蛋白酶體途徑和激素的合成或信號轉導會協同作用來影響植物對非生物脅迫的響應[30-31]，以維持植株的正常生長，但對逆境脅迫響應是否與植株體內激素豐度的調節和信號的轉導有關還有待研究。我們通過原核表達獲得了MaUBC-C的蛋白，后續研究中將進一步驗證其體外的活性，解析基因在桑樹的激素信號傳導、非生物脅迫、免疫反應中的作用。本研究克隆了基因，分析了其在外源激素處理和非生物脅迫下的表達模式，并獲得了MaUBC-C蛋白，為揭示泛素-蛋白酶體途徑在桑樹中的作用機制提供了理論依據。

[1] VIERSTRA R D. The ubiquitin–26S proteasome system at the nexus of plant biology[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009, 10(6): 385-397.

[2] CALLIS J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system[J]. The Arabidopsis Book, 2020, 2014(12): e174.

[3] WIJK S J L, TIMMERS H T M. The family of ubiquitin-conjugating enzymes (): deciding between life and death of proteins[J]. The FASEB Journal, 2009, 24(4): 981-993.

[4] ZHOU B, MURAL R V, CHEN X, OATES M E, CONNOR R A, MARTIN G B, GOUGH J, ZENG L. A subset of ubiquitin-conjugating enzymes is essential for plant immunity[J]. Plant Physiology, 2017, 173(2): 1371-1390.

[5] CUI F, LIU L, LI Q, YANG C, XIE Q. UBC32 mediated oxidative tolerance in[J]. Journal of Genetics and Genomics, 2012, 39(8): 415-417.

[6] WANG S, CAO L, WANG H.ubiquitin-conjugating enzyme UBC22 is required for female gametophyte development and likely involved in Lys11-linked ubiquitination[J]. Journal of Experimental Botany, 2016, 67(11): 3277-3288.

[7] WANG S, LI Q, ZHAO L, FU S, QIN L, WEI Y, FU Y, WANG H.UBC22, an E2 able to catalyze lysine-11 specific ubiquitin linkage formation, has multiple functions in plant growth and immunity[J]. Plant Science, 2020, 297: 110520.

[8] 毛卓卓, 宮 宇, 史貴霞, 李亞麗, 喻德躍, 黃 方. 大豆E2泛素結合酶基因的克隆及在擬南芥中的異源表達[J]. 遺傳, 2020, 42(8): 788-798.

MAO Z Z, GONG Y, SHI G X, LI Y L, YU D Y, HUANG F. Cloning of the soybean E2 ubiquitin-conjugating enzymeand its expression in[J]. Hereditas, 2020, 42(8): 788-798. (in Chinese)

[9] 李興涵, 費小雯, 李亞軍, 鄧曉東. 萊茵衣藻E2泛素結合酶調控油脂積累[J]. 微生物學報, 2020, 60(3): 499-511.

LI X H, FEI X W, LI Y J, DENG X D. Ubiquitin-conjugating enzyme (E2)regulates lipid accumulation in[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2020, 60(3): 499-511. (in Chinese)

[10] 雷朝霞, 劉 晶, 白易平, 唐 唯, 王洪洋. 馬鈴薯泛素結合酶基因的克隆與功能分析[J]. 生物技術通報, 2019, 35(1): 35-41.

LEI Z X, LIU J, BAI Y P, TANG W, WANG H Y. Cloning and functional analysis of a potato ubiquitin-conjugating enzyme gene[J]. Biotechnology Bulletin, 2019, 35(1): 35-41. (in Chinese).

[11] DIAO Y, LI G L, YU A Q, ZHENG X W, XIE K Q, WANG Y W, ZHOU M Q, MING J, HU Z L. Cloning and characterization of thegene from lotus ()[J]. Brazil, 2016, 15(3): 15038341.

[12] 王金利, 史勝青, 賈利強, 江澤平. 植物泛素結合酶E2功能研究進展[J]. 生物技術通報, 2010(4): 7-10.

WANG J L, SHI S Q, JIA L Q, JIANG Z P. Progress on functions of ubiquitin-conjugating enzyme (E2) in plants[J]. Biotechnology Bulletin, 2010(4): 7-10. (in Chinese).

[13] KRAFT E, STONE S L, MA L, SU N, GAO Y, LAU O, DENG X, CALLIS J. Genome analysis and functional characterization of the E2 and RING-Type E3 ligase ubiquitination enzymes of[J]. Plant Physiology, 2005, 139(4): 1597-1611.

[14] DONG C, HU H, JUE D, ZHAO Q, CHEN H, XIE J, JIA L. The bananagene family: genomic identification, characterization, expression profiling analysis[J]. Plant Science, 2016, 245: 11-24.

[15] LIU W, TANG X, ZHU X, QI X, ZHANG N, SI H. Genome-wide identification and expression analysis of the E2 gene family in potato[J]. Molecular Biology Reports, 2019, 46(1): 777-791.

[16] SHARMA B, BHATT T K. Genome-wide identification and expression analysis of E2 ubiquitin-conjugating enzymes in tomato[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 8613.

[17] JIA L, ZHAO Q, CHEN S. Evolution and expression analysis of the sorghum ubiquitin-conjugating enzyme family[J]. Functional Plant Biology, 2019, 46(3): 236.

[18] GAO Y, WANG Y, XIN H, LI S, LIANG Z. Involvement of ubiquitin-conjugating enzyme (E2 gene family) in ripening process and response to cold and heat stress of[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 13290.

[19] JUE D, SANG X, LU S, DONG C, ZHAO Q, CHEN H, JIA L. Genome-wide identification, phylogenetic and expression analyses of the ubiquitin-conjugating enzyme gene family in maize[J]. PLoS One, 2015, 10(11): e143488.

[20] CHEN L, SUN D, ZHANG X, SHAO D, LU Y, AN Y. Transcriptome analysis of yellow passion fruit in response to cucumber mosaic virus infection[J]. PLoS One, 2021, 16(2): e247127.

[21] EINI O, DOGRA S, SELTH L A, DRY I B, RANDLES J W, REZAIAN M A. Interaction with a host ubiquitin-conjugating enzyme is required for the pathogenicity of a geminiviral DNA beta satellite[J]. Mol Plant Microbe Interact, 2009, 22(6): 737-746.

[22] IMURA Y, MOLHO M, CHUANG C, NAGY P D. Cellular Ubc2/Rad6 E2 ubiquitin-conjugating enzyme facilitates tombusvirus replication in yeast and plants[J]. Virology, 2015, 484: 265-275.

[23] JUE D, SANG X, LIU L, SHU B, WANG Y, XIE J, LIU C, SHI S. The ubiquitin-conjugating enzyme gene family in longan (Lour.): genome-wide identification and gene expression during flower induction and abiotic stress responses[J]. Molecules, 2018, 23(3): 662.

[24] AHN M Y, OH T R, SEO D H, KIM J H, CHO N H, KIM W T.group XIV ubiquitin-conjugating enzymes AtUBC32, AtUBC33, and AtUBC34 play negative roles in drought stress response[J]. Journal of Plant Physiology, 2018, 230: 73-79.

[25] SUN Y, ZHAO J, LI X, LI Y. E2 conjugases UBC1 and UBC2 regulate MYB42-mediated SOS pathway in response to salt stress in[J]. New Phytologist, 2020, 227(2): 455-472.

[26] 陳 曙, 趙秋芳, 陳宏良, 金 輝. 玉米泛素結合酶基因家族分析及低氮脅迫下亞家族UBC2的表達分析[J]. 熱帶作物學報, 2020, 41(2): 305-314.

CHEN S, ZHAO Q F, CHEN H L, JIN H. Bioinformatics analysis of ubiquitin-conjugating enzymes and expression analysis of UBC2 gene sub-family in response to low nitrogen stress in maize[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2020, 41(2): 305-314. (in Chinese)

[27] ALAZEM M, HE M, MOFFETT P, LIN N. Abscisic acid induces resistance againstthrough2 and 3[J]. Plant Physiology, 2017, 174(1): 339-355.

[28] ALAZEM M, TSENG K, CHANG W, SEO J, KIM K. Elements involved in the Rsv3-mediated extreme resistance against an avirulent strain of[J]. Viruses, 2018, 10(11): 581.

[29] CHAKRABORTY N, BASAK J. Exogenous application of methyl jasmonate induces defense response and develops tolerance againstin[J]. Functional Plant Biology, 2019, 46(1): 69-81.

[30] 烏鳳章, 王賀新. 蛋白質泛素化介導的植物低溫脅迫反應[J]. 生物技術通報, 2021,37(6): 225-235.

WU F Z, WANG H X. Low temperature stress response mediated by protein ubiquitination in plant[J]. Biotechnology Bulletin, 2021, 37(6): 225-235. (in Chinese)

[31] SHARMA S, PRASAD A, SHARMA N, PRASAD M. Role of ubiquitination enzymes in abiotic environmental interactions with plants[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 181: 494-507.

Expression Pattern Analysis and Prokaryotic Expression ofGene in Mulberry

ZHAO Xinru1, MO Yingxi1, LI Jieqiu2, MENG Jiaorong1*

1. College of Agriculture, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China; 2. Agri-animal Industuial Development Institute, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004, China

Ubiquitin-conjugating enzyme (E2) plays an important role in plants and participates in physiological activities such as plant growth and development, stress, immune response and so on. In previous research, we profiled the transcriptome of ‘Guisangyou 62’ which infested with mulberry vein binding-associated virus (MVBaV) to obtain the up-regulated expression gene. In order to explore the function of, the CDS sequence ofwas cloned from mulberry for bioinformatics and expression pattern analysis, and MaUBC-C was obtained by prokaryotic expression. The results showed that the coding region ofwas 567 bp, coding 188 amino acids, and it was predicted to target the nuclear. MaUBC-C was 21.03 KDa and belonged to hydrophilic, acidic and unstable protein with a conserved UBC domain. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of UBC inand other species showed thatMaUBC-C had the highest similarity with the homologous MnUBC from, which was 98.40%. Thereal-time fluorescence quantitative PCR data showed thatwas expressed in roots, stems and leaves, and the highest expression was in roots, which were 1.24 and 1.71 times higher than those in stems and leaves, respectively. And we foundresponded to differently to different (ABA, GA, MeJA, SA) and abiotic stress (low temperature, high temperature, high salt, drought).Among them,was significantly up-regulated after treatment with ABA and MeJA, as the expression at 24 h was 29.55 and 9.05 times of the normal level, respectively. It is speculated that MaUBC-C may extensively regulate the growth and development of mulberry, participating in the hormonal signal transduction and defense responses to abiotic stresses. The prokaryotic expression vector pET-30a-was constructed and transformed intoBL21 to induce the expression ofwith 0.5 mmol/L IPTG at 37℃. SDS-PAGE gel showed that a band with a size of about 25 kDa appeared from 2 h, the size was basically consistent with the expectation. And Western-blot showed that it could react specifically with His-tag monoclonal antibody indicating thatwas successfully expressed, which provided basic materials for functional research of. The results of this study would providea theoretical basis for further exploring the mechanism of action of the ubiquitin proteasome pathway in mulberry.

mulberry; ubiquitin-conjugating enzyme; expression pattern; prokaryotic expression

S888.2

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.11.010

2022-01-25；

2022-03-14

廣西自然科學基金重點項目（No. 2017GXNSFDA198004）；國家自然科學基金項目（No. 31660036）。

趙鑫茹（1996—），女，碩士研究生，研究方向：植物病理學。*通信作者（Corresponding author）：蒙姣榮（MENG Jiaorong），E-mail：mengjiaorong@163.com。