MicroRNA-181b對2型糖尿病胰島素分泌調節的作用及其機制研究*

曾維新，云川，李曉燕，李大偉

（海南醫學院第一附屬醫院 內分泌科，海南 海口 570102）

糖尿病是一種常見的內分泌疾病，包括1 型和2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM），其中T2DM 可發生于任何年齡，是最主要的糖尿病類型。隨著我國人民生活水平的提高和飲食方式的改變，T2DM 發病率逐年升高。目前約11.6%成年人患T2DM，預計到本世紀40 年代，國內糖尿病患者將會超過6億[1]。胰島β 細胞功能缺陷導致的胰島素缺乏和胰島素抵抗（insulin resistance,IR）是T2DM 患者發病的最主要原因[2]。MicroRNA（miRNA）是一種具有保守序列的微小RNA，可以通過抑制或促進RNA降解來調節后續基因的表達。有研究發現，肥胖與瘦人群的miRNA 表達有顯著差異[3]，而肥胖引起的脂質超載與T2DM 發病關系密切。DEHGHANI等[4]發現，T2DM 患者血清miR-181b 水平異常。NDRG2是NDRG 家族成員，與miRNA 類似，具有高度保守性。近年來研究發現，NDRG2 在糖尿病小鼠的胰腺中異常表達，可能參與胰島素分泌[5]；同時腫瘤相關研究發現，NDRG2 可能是miR-181b 的下游靶基因[6]。基于此，本研究觀察miR-181b 能否通過靶向調控下游基因NDRG2參與IR，探究其在T2DM 發病中的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑及儀器

細胞株選用小鼠胰島β 細胞（美國ATCC）。熒光素酶檢測試劑盒（美國Biovision 公司），miR-181b模擬物、miR181b inhibitor、陰性對照（上海吉滿生物科技有限公司），轉染試劑盒（賽默飛世爾科技中國有限公司），NDRG2 單克隆抗體、二抗（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶（北京中杉金橋生物技術公司）。二氧化碳培養箱（常州恒隆儀器有限公司），酶標儀（賽默飛世爾科技中國有限公司），二級生物安全柜（BSC-1100IIA2-X，濟南歐萊博科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養采用含10 μL/L β-巰基乙醇和10%胎牛血清的DMEM 高糖培養液培養小鼠胰島β細胞，培養條件為：37℃、5%二氧化碳培養箱恒溫培養，當細胞生長至融合度＞80%開始進行細胞傳代。

1.2.2 轉染首先使用預測軟件Targetsca（http://www.targetscan.org）和miRanda（http://www.microrna.org/microrna/home.do）進行靶基因預測，利用Primer 5.0軟件進行引物設計，構建NDRG2 野生型（NDRG2WT-1uc）與突變型（NDRG2MUT-1uc）熒光素酶報告基因質粒。

1.2.3 熒光素酶報告基因實驗檢測相對熒光強度將培養后的小鼠胰島β 細胞接種于24 孔板，繼續培養過夜，待完全貼壁后采用脂質體轉染法轉染，分為Control 組（陰性對照）、NDRG2-WT 組（轉染NDRG2WT-luc）、NDRG2-MUT組（轉染NDRG2MUT-luc）、miR-181b mimics+NDRG2-WT 組（轉染miR-181b 模擬物和NDRG2WT-luc）、miR-181b mimics+NDRG2-MUT 組（轉染miR-181b 模擬物和NDRG2MUT-luc）、miR-181b inhibitor+NDRG2-WT 組（轉 染miR-181b inhibitor 和 NDRG2WT-luc）、miR-181 binhibitor+NDRG2-MUT 組（轉 染 miR-181b inhibitor 和NDRG2MUT-luc）。轉染48 h 的細胞將用于后續實驗。轉染結束后檢測海腎和螢火蟲熒光素酶的熒光強度，以兩者的比值來衡量相對活性，反映miR-181b與NDRG2 結合情況。

1.2.4 過表達和抑制 NDRG2根據LipofectamineTM2000 試劑盒說明書進行操作，所有質粒購自美國Addgene 公司。將pLenti6-NDRG2（過表達組）、pLenti6-Cherry（過表達對照組）、pLKONDRG2 shRNA（敲低組）、pLKO-Scramble（敲低對照組）分別與psPAX2 質粒、pMD2.G 質粒共同轉染至小鼠胰島β 細胞，轉染后48 h 取上清液，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測NDRG2 mRNA 的表達（按2-ΔΔCt法計算相對表達量）；Western blotting 檢測NDRG2 蛋白的表達；葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗檢測低濃度（5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡萄糖條件下的胰島素分泌量。

1.2.5 qRT-PCR檢測 miR-181b 和 NDRG2 mRNA未轉染的小鼠胰島β 細胞培養48 h后，予以低濃度（5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡萄糖刺激，收集上清液，以未加入葡萄糖為對照組，采用qRT-PCR 檢測5 mmol/L 葡萄糖組、20 mmol/L 葡萄糖組及對照組小鼠胰島β 細胞內源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 表達。

1.2.6 葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗檢測胰島素分泌量在低濃度（5 mmol/L）和高濃度（20 mmol/L）葡萄糖條件下，將miR-181b 模擬物（miR-181b mimics組）、miR-181b 抑制劑（miR-181b inhibitor 組）、陰性對照（Control 組）轉染至小鼠胰島β 細胞中，轉染48 h 后采用葡萄糖刺激的胰島素釋放試驗檢測胰島素分泌量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，多組比較用方差分析，進一步兩兩比較用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組相對熒光強度比較

Control 組相對熒光強度為（100.00±1.01）%、NDRG2-WT 組為（104.20±3.04）%、NDRG2-MUT 組為（98.00±2.12）%、miR-181b mimics+NDRG2-WT 組為（63.27±5.16）%、miR-181b mimics+NDRG2-MUT組 為（96.67±2.23）%、miR-181b inhibitor+NDRG2-WT組為（133.59±4.48）%、miR-181 binhibitor+NDRG2-MUT 組為（97.13±1.0）%。各組相對熒光強度比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=46.325，P=0.000）。見圖1。

圖1 miR-181b與NDRG2靶基因結合位點示意圖

熒光素酶報告基因實驗檢測發現，miR-181b模擬物可以明顯抑制NDRG2WT-luc 的3'-端非翻譯區的表達，但對NDRG2-MUT 組和Control 組無明顯影響；miR-181b inhibitor 可以加強NDRG2WT-luc 的3'-端非翻譯區的表達，但對NDRG2-MUT 組和Control 組無明顯影響。說明miR-181b 可以通過與NDRG2 的3'-端非翻譯區結合來調控NDRG2 的表達。

2.2 NDRG2對胰島素分泌的影響

過表達組與過表達對照組NDRG2 mRNA 和蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），過表達組均高于過表達對照組。在5 mmol/L 葡萄糖條件下，過表達組與過表達對照組胰島素分泌量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖條件下，過表達組與過表達對照組胰島素分泌量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），過表達對照組高于過表達組。見表1 和圖2。

表1 過表達組與過表達對照組NDRG2 mRNA和蛋白相對表達量、胰島素分泌量比較（）

表1 過表達組與過表達對照組NDRG2 mRNA和蛋白相對表達量、胰島素分泌量比較（）

敲低組與敲低對照組NDRG2 mRNA 和蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），敲低組均低于敲低對照組。在5 mmol/L 葡萄糖條件下，敲低組與敲低對照組胰島素分泌量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖條件下，敲低組與敲低對照組胰島素分泌量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），敲低組高于敲低對照組。見表2 和圖2。

表2 敲低組與敲低對照組NDRG2 mRNA和蛋白相對表達量、胰島素分泌量比較（）

表2 敲低組與敲低對照組NDRG2 mRNA和蛋白相對表達量、胰島素分泌量比較（）

圖2 NDRG2蛋白的表達

2.3 高糖刺激對小鼠胰島β細胞內源性miR-181b和NDRG2 mRNA表達的影響

5 mmol/L 葡萄糖組、20 mmol/L 葡萄糖組及對照組小鼠胰島β 細胞內源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：5 mmol/L葡萄糖組與對照組的miR-181b 和NDRG2 mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；20 mmol/L 葡萄糖組miR-181b 相對表達量高于對照組和5 mmol/L 葡萄糖組（P＜0.05），NDRG2 mRNA 相對表達量低于對照組和5 mmol/L 葡萄糖組（P＜0.05）。見表3。

表3 3組小鼠胰島β細胞內源性miR-181b和NDRG2 mRNA相對表達量比較（）

表3 3組小鼠胰島β細胞內源性miR-181b和NDRG2 mRNA相對表達量比較（）

注：?與5 mmol/L葡萄糖組和對照組比較，P ＜0.05。

2.4 miR-181b對胰島素分泌的影響

5 mmol/L葡萄糖條件下，Control 組、miR-181b mimics 組、miR-181b inhibitor 組胰島素分泌量比較，經方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。在20 mmol/L 葡萄糖條件下，3 組胰島素分泌量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結果：miR-181b mimics 組高于Control 組（P＜0.05），miR-1b1 inhibitor 組低于Control組和miR-181b mimics 組（P＜0.05）。見表4。

表4 不同濃度葡萄糖條件下各組胰島素分泌量比較（IU，）

表4 不同濃度葡萄糖條件下各組胰島素分泌量比較（IU，）

注：①與Control 組比較，P ＜0.05；②與miR-181b mimics 組比較，P ＜0.05。

3 討論

T2DM 占總的糖尿病人群的90%以上，是主要的糖尿病類型，也是僅次于心血管疾病和惡性腫瘤的嚴重危害人類健康的慢性疾病，該病由基因和環境等多種因素導致，主要特征是胰島素相對或絕對不足導致高血糖狀態，胰島β 細胞分泌胰島素功能障礙導致骨骼肌、肝臟、脂肪等組織發生胰島素抵抗是T2DM 發病的主要原因。胰島素是由胰島β 細胞分泌的特異性激素，可以通過與肌肉、肝臟和脂肪等組織上的特異性受體結合，來調節葡萄糖代謝，維持血液葡萄糖穩定狀態。胰島素的分泌不僅受胰島素基因的調控，而且受外源性營養物質和內源性因子的影響。隨著分子生物學的飛躍發展，近年來研究發現糖尿病患者miRNA 譜表達異常[7]，miRNA 異常表達可能與胰島β 細胞功能障礙、T2DM病情進展關系密切。

miRNA 是一類短鏈的非編碼RNA，可以通過與其他靶基因的3'-非編碼區結合，來調控其他RNA的轉錄和翻譯。有研究表明，miR-181b 在肥胖小鼠中低表達，外源性注射miR-181b 后其胰島素敏感性提高[8]。COPIER等[9]報道外周循環miR-181b 是糖尿病心肌病的生物標志物，可能是研究T2DM 的新靶點。本研究前期預實驗發現NDRG2 上可能存在miR-181b 的靶向結合位點，且兩者都與胰島素抵抗關系密切，故本研究以小鼠胰島β 細胞株為研究對象，觀察miR-181b 是否能夠通過靶向調控NDRG2參與T2DM 的發生、發展。熒光素酶報告基因實驗檢測結果發現，miR-181b mimics 和inhibitor 可以顯著影響野生型NDRG2WT-luc 的3'-端非翻譯區表達，但對突變型NDRG2MUT-1uc 和陰性對照無明顯影響，提示miR-181b 可以通過與NDRG2 的3'-端非翻譯區結合來調控NDRG2 的表達。高楠等[10]在胃癌細胞的培養過程中同樣發現miR-181b 能與NDRG2 的3'-UTR 結合，提示miR-181b 可以與NDRG2 的3'-UTR結合。

小鼠胰島β 細胞的胰島素分泌功能與人體胰腺有高度相似性，是研究胰島素分泌和糖尿病的理想細胞株之一。LI等[11]在腎癌細胞中發現，提高miR-181b 表達能抑制包括NDRG2 在內的多種基因表達。高楠等[10]在胃癌細胞中通過熒光素酶報告基因分析發現NDRG2 為miR-181b 的下游靶基因，提出通過抑制miR-181b 的表達來抑制NDRG2，進一步干擾細胞侵襲作用。NDRG2 屬于NDRG 家族一員，位于染色體14q11.1，其在進化上非常保守，提示該基因在人類生命過程中具有重要作用。NDRG2 高表達于人體骨骼肌中，不僅參與腫瘤、氧化應激、細胞分化、增殖、凋亡等眾多生理活動[12]，而且可能通過蛋白激酶Akt 磷酸化調節胰島素分泌[12]。有學者通過Western blotting 檢測糖尿病小鼠胰島和骨骼肌NDRG2，發現胰腺NDRG2 表達增強[14]。本研究通過過表達和敲低NDRG2基因來驗證NDRG2 是否能直接影響胰島素分泌，結果發現在20 mmol/L 高糖刺激下，過表達組胰島素分泌量顯著降低，而敲低組則顯著升高，提示NDRG2 對胰島素分泌具有抑制作用。為了進一步探討miR-181b 對NDRG2 的靶向調控是否會影響小鼠胰島β 細胞分泌胰島素，本研究進一步檢測了胰島素分泌量，結果發現在20 mmol/L 葡萄糖刺激下，小鼠胰島β 細胞內源性miR-181b 相對表達量顯著升高，NDRG2 mRNA 相對表達量顯著降低，但是在5 mmol/L 葡萄糖刺激下無顯著變化，說明高糖刺激會影響小鼠胰島β 細胞內源性miR-181b 和NDRG2 mRNA 表達變化，這2 個基因可能直接參與胰島素分泌的調控。進一步添加miR-181b mimics 和 miR-181b inhinitor 并給予20 mmol/L 葡萄糖刺激后發現，miR-181b mimics 能顯著提高NDGR2 表達，同時胰島素分泌量顯著升高，而miR-181b inhibitor 能顯著下調NDGR2 表達，且胰島素分泌量隨之下降。這為miR-181b 能通過靶向調控NDRG2 介導胰島素分泌，并參與T2DM 的發病過程提供了直接證據。

綜上所述，miR-181b 不影響小鼠胰島β 細胞增殖，但可以通過靶向抑制NDRG2 的表達來提高胰島素分泌，可以為T2DM 的發病機制研究和治療提供新思路。