鹽酸納美芬對大腦中動脈缺血再灌注模型大鼠腦組織的作用及其機制研究*

朱江，郭森，竇志杰，張弛

（承德醫學院附屬醫院 神經內科，河北 承德 067000）

腦卒中又稱腦血管意外，是一種常見的急性腦血管疾病，一般分為缺血性卒中和出血性卒中，具有較高的發病率、病死率和致殘率[1]。近年來腦卒中發病率呈上升趨勢，且逐漸年輕化[2]。臨床上以溶栓和機械取栓為腦卒中的主要治療手段，取栓后雖然能恢復腦組織血液灌注，但是缺血造成的腦神經損傷卻無法修復，因此多數患者預后不良，伴有不同程度的身體殘疾[3]。既往研究結果顯示，在及時有效的治療下，中樞神經元可以再生，腦組織損傷或可逆[4]。鹽酸納美芬是阿片受體拮抗劑，具有抗休克、腦保護和治療脊髓損傷等作用。既往研究結果顯示，鹽酸納美芬可以減少七氟烷麻醉大鼠神經元凋亡，提高認知能力[5]。目前關于鹽酸納美芬對大腦中動脈缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）神經保護作用的報道很少，因此本研究采用鹽酸納美芬預注射，探究其對大腦中動脈缺血再灌注大鼠模型的神經保護作用，以期為臨床治療腦卒中提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級雄性SD大鼠36只，體重（220±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010，實驗動物使用許可證號：SYXK（冀）2021-004。適應性飼養1周，正常飼養供水。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑鹽酸納美芬注射液（1 mg/mL，國藥準字H20080652，遼寧海思科制藥有限公司），大鼠超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（批 號：ml077379）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）ELISA 試劑盒（批 號：ml077384）（上海酶聯生物科技有限公司），TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1091，上海碧云天生物科技有限公司），腦組織蛋白提取試劑盒（批號：ml077391，上海酶聯生物科技有限公司），Caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH 兔抗大鼠一抗、羊抗兔HRP 標記二抗（美國Abcam 公司）。

1.2.2 主要儀器光學顯微鏡（日本Olympus 公司），酶標分析儀（美國Thermo 公司），Sigma 3-18K臺式速冷凍離心機（德國Sigma 公司），Tissuelyser Ⅱ高通量組織研磨儀（德國Qiagen 公司），Gel Doc 凝膠成像系統（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 MCAO/R 模型的復制采用線栓法復制MCAO/R）模型[6]，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，側臥固定于手術臺上，在頸部右側做長約2 cm 切口，鈍性分離頸總動脈（common carotid artery,CCA）與鄰近肌肉和神經，暴露頸外動脈（external carotid artery,ECA）、頸內動脈（internal carotid artery,ICA），結扎CCA、ECA，動脈夾夾緊ICA，用眼科剪在ECA 與ICA 分叉處做1 mm 切口，置入外科手術尼龍線并輕輕向內推進，直至遇到明顯阻力，則表明尼龍線已經到達大腦中動脈起始端，固定尼龍線。缺血2 h后，緩慢抽出尼龍線約10 min 形成缺血再灌注損傷，逐層縫合切口。整個過程中大鼠置于37℃恒溫箱中保持體溫。

1.3.2 實驗分組與給藥將36 只大鼠隨機分為假手術組、模型組、鹽酸納美芬組，各12 只。鹽酸納美芬組大鼠復制MCAO/R 模型前10 min 尾靜脈注射20 μg/kg 鹽酸納美芬注射液，假手術組和模型組注射等體積生理鹽水。隨后除假手術組（不進行CCA、ECA 結扎）外，其余兩組采用線栓法復制MCAO/R 模型。

1.3.3 神經功能評分MCAO/R 模型復制完成后，放回鼠籠恢復24 h，參照Longa 評分標準進行大鼠神經功能評分[7]：正常（無神經損傷癥狀）計0 分；輕度（提尾時左前爪不張）計1 分；中度（行走時向左盤旋）計2 分；重度（行走困難，向左傾斜）計3 分；極嚴重（不能自發行走）計4 分。

1.3.4 ELISA檢測腦組織SOD活性、MDA含量神經功能評分后，每組隨機選取4 只大鼠，立即處死后取頭，迅速于冰上解剖分離大鼠右側腦組織，加入適量生理鹽水，4℃勻漿腦組織，3 000 r/min離心10 min，取上清液，參照試劑盒說明書加入待測樣本，最后在450 nm 波長下讀取各孔光密度（optical density,OD）值，根據OD 值計算SOD 活性、MDA 含量。

1.3.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色觀察腦組織病理變化每組隨機選取4 只大鼠，腹腔內注射1%戊巴比妥鈉麻醉，開胸行主動脈插管，用200 mL 生理鹽水快速沖洗，隨后灌入4%多聚甲醛400 mL 固定，常規石蠟包埋，切片機切腦組織厚約5 μm。取切片烤干，加二甲苯脫蠟，重復1次，加乙醇脫苯，重復1次，洗凈乙醇后常規HE染色，在顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.3.6 TUNEL染色觀察細胞凋亡取1.3.5 中腦組織切片，加入二甲苯脫蠟10 min，重復1 次。加入無水乙醇5 min，90%乙醇2 min，70%乙醇2 min，蒸餾水沖干凈。滴加不含DNase 的蛋白酶K 20 μg/mL，37℃、20 min。PBS 洗滌3次，除去蛋白酶K。加入內源性過氧化物酶強力封閉液，室溫下孵育20 min，滅活切片中的內源過氧化物酶，PBS 洗滌3 次。參照TUNEL 試劑盒說明書，配制生物素標記液，現用現配。切片上滴加50 μL 生物素標記液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌1次，再滴加0.2 mL 標記反應終止液，室溫下孵育10 min。參照試劑盒說明書配制Streptavidin-HRP 工作液 和DAB 顯色液。PBS 洗滌3次，滴加50 μL Streptavidin-HRP 工作液，室溫孵育30 min，滴加0.3 mL DAB顯色液，室溫孵育20 min[8]。PBS 洗滌3次，在顯微鏡下觀察細胞凋亡情況，隨機選取5 個視野，計算每個視野中凋亡細胞數并記錄平均值（視野中棕色為陽性凋亡細胞）。

1.3.7 Western blotting 檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表達各組隨機選取4 只大鼠，處死后取頭，于冰上解剖分離右側腦組織，加入組織蛋白提取液，組織勻漿器勻漿，4℃、12 000 r/min 離心5 min，取上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白20 μg，通過SDS-PAGE 分離蛋白并轉移至PVDF 膜。5%脫脂牛奶封閉后，將PVDF 膜與Caspase-3、Bax、Bcl-2一抗體在4℃孵育過夜。緩沖液洗膜3次，PVDF 膜與二抗孵育1 h，洗膜3次，顯色液顯色。采用ImageJ軟件定量分析蛋白相對表達量，以GAPDH 為內參。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用方差分析或t檢驗，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠神經功能損傷情況

假手術組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠神經功能評分分別為（0.00±0.00）分、（3.14±0.58）分和（2.21±0.41）分。假手術組分別與模型組、鹽酸納美芬組大鼠神經功能評分比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=18.754和18.672，均P=0.000），假手術組大鼠神經功能評分較低。模型組與鹽酸納美芬組大鼠神經功能評分比較，差異有統計學意義（t=4.536，P=0.000），鹽酸納美芬組大鼠神經功能評分低于模型組。

2.2 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較

假手術組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠腦組織SOD 活性、MDA 含量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=9.211 和15.625，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：模型組、鹽酸納美芬組SOD 活性低于假手術組（P＜0.05），MDA 含量高于假手術組（P＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬組SOD 活性升高（P＜0.05），MDA 含量降低（P＜0.05）。見表1。

表1 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較（n=4，）

表1 3組大鼠腦組織SOD活性、MDA含量比較（n=4，）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

2.3 3組大鼠腦組織病理變化

假手術組細胞輪廓清晰，排列有序。模型組細胞破損，數量減少，炎癥浸潤嚴重。鹽酸納美芬組細胞數量較多，輪廓清晰，炎癥浸潤減少（見圖1）。

圖1 3組大鼠腦組織病理變化（HE染色×400）

2.4 3組大鼠腦組織凋亡細胞數比較

假手術組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠凋亡細胞數分別為（4.12±1.07）個/HP、（52.87±10.54）個/HP和（30.76±8.57）個/HP，經方差分析，差異有統計學意義（F=38.508，P=0.000）。進一步兩兩比較結果：模型組、鹽酸納美芬組凋亡細胞數多于假手術組（P＜0.05）；鹽酸納美芬組凋亡細胞數少于模型組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組大鼠腦組織細胞凋亡情況（TUNEL染色×200）

2.5 3 組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量比較

假手術組、模型組、鹽酸納美芬組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=29.871、33.992 和14.459，均P=0.000）。進一步兩兩比較結果：模型組、鹽酸納美芬組Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量高于假手術組（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量低于假手術組（P＜0.05）；與模型組相比，鹽酸納美芬組Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見 表2和圖3。

表2 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（n=4，）

表2 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相對表達量比較（n=4，）

注：①與假手術組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

圖3 3組大鼠腦組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表達

3 討論

缺血性腦卒中是腦血管堵塞引起的腦損傷疾病，發病原因為大腦中動脈出現梗死，中斷腦組織供血。即使在短時間內恢復供血，腦組織也會受到不同程度的損傷，使腦神經功能受損[9]。目前臨床上常采用組織型纖溶酶原激活物（tissue-type plasminogen activator,t-PA）進行血栓溶解[10]，但t-PA有效時間窗口狹窄（4.5 h 內），并且恢復血液灌注后，受損的腦組織神經元難以修復，因此尋找具有神經保護作用的藥物對治療腦組織缺血再灌注導致的神經損傷具有重要意義。鹽酸納美芬與其他阿片受體拮抗劑一樣，具有抗昏迷、抗休克等作用。鹽酸納美芬可以透過血腦屏障，注射后可以迅速到達腦組織，促進損傷神經的修復，具有修復受損神經元的作用[11]。既往研究結果顯示，臨床上治療急性腦梗死時，在常規治療基礎上加用鹽酸納美芬可以提高療效[12]。

本研究結果顯示，模型組大鼠出現行走困難，并向左傾斜的癥狀，說明右側腦組織損傷嚴重；鹽酸納美芬組大鼠行走時雖向左盤旋，但行走障礙不明顯，說明右腦神經功能得到部分修復。腦組織缺血再灌注過程會產生大量的氧自由基，導致脂質過氧化，破壞細胞膜，損傷神經元[13]。MDA 是脂質過氧化的終產物[14]。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠MDA 含量升高，說明MCAO/R后，大鼠腦組織中脂質過氧化反應水平升高，腦組織氧化損傷嚴重。與模型組相比，預注射鹽酸納美芬后大鼠腦組織MDA 含量降低。SOD 參與氧自由基的清除，對抗機體氧化應激反應[15]。本研究中，與模型組相比，預注射鹽酸納美芬的大鼠腦組織SOD 活性升高，說明腦組織抗氧化水平提高。通過HE 染色發現，MCAO/R 對腦組織造成損害，細胞破損嚴重，炎癥浸潤增加，而預注射鹽酸納美芬后，大鼠腦組織炎癥浸潤減少，細胞數量增多，提示鹽酸納美芬具有一定腦組織保護作用。

腦組織缺血時，神經元會激活小膠質細胞，釋放活性氧（reactive oxygen species,ROS）。ROS 刺激線粒體釋放細胞色素C（cytochrome C,Cyt-C），與凋亡蛋白酶激活因子形成聚合物，激活細胞凋亡終末蛋白Caspase-3，促進凋亡的發生。Bcl-2 是細胞中重要的抗凋亡基因，其通過抑制細胞中蓄積的Cyt-C和Caspase-3，達到抑制細胞凋亡的作用。Bax屬于Bcl-2基因家族，過表達拮抗Bcl-2 形成二聚體，抑制Bcl-2 的保護作用[16-17]。本研究中，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量升高，Bcl-2 蛋白相對表達量降低，說明MCAO/R時腦組織發生氧化應激反應，造成腦組織損傷，大量細胞凋亡。當預注射鹽酸納美芬后，與模型組相比，鹽酸納美芬組大鼠腦組織Caspase-3、Bax 蛋白相對表達量降低，Bcl-2 蛋白相對表達量升高，提示鹽酸納美芬可以抑制氧化應激發生，具有神經保護作用；并且通過TUNEL 染色觀察到，相比模型組，鹽酸納美芬組大鼠腦組織凋亡細胞減少。

綜上所述，鹽酸納美芬具有抗氧化應激作用，可抑制細胞凋亡，保護腦神經。其作用機制與調控Caspase-3/Bcl-1/Bax 通路有關，但具體調控機制有待進一步研究證實。