妊娠期糖尿病患者血清microRNA-122、血管內(nèi)皮生長因子的表達及與圍生兒結(jié)局的關系*

楊雅嵋，張程舉，胡灝懿，劉勝鳳，冉偉

（1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 南充 637002；2.南充市中醫(yī)醫(yī)院 婦產(chǎn)科，四川 南充 637000）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）會使胎盤基底膜、胎盤的細胞功能及其細胞外基質(zhì)發(fā)生改變，影響胎盤生長，導致胎兒營養(yǎng)物質(zhì)運輸與吸收障礙，進一步造成胎兒生長發(fā)育異常[1]。目前GDM 的發(fā)病機制尚未完全明確，現(xiàn)公認的發(fā)病機制有拮抗胰島素激素水平升高、胰島素對抗等[2]。近年來，有學者提出GDM 與2 型糖尿病的發(fā)病機制相似[3]。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）主要通過增加血管通透性參與糖尿病發(fā)病機制，改變血管內(nèi)皮細胞基因表達及促進該基因的有絲分裂，誘導新血管生成[4]。VEGF 在糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變的血管改變中均起重要作用[5]。調(diào)控基因表達主要分為mRNA 翻譯為蛋白質(zhì)和調(diào)控DNA 的轉(zhuǎn)錄過程，前者為非編碼RNA 的調(diào)控，以microRNA（miRNA）最受關注[6]。越來越多研究證實，miRNA 能夠調(diào)控血糖的代謝過程，不過有關miR-122 在糖尿病的表達研究較少。本研究目的在于探討miR-122、VEGF 是否參與GDM 病理的改變，并分析兩者對GDM 患者圍生兒結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年5 月—2020 年1 月川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的GDM 患者80例作為研究組。其中，初產(chǎn)婦52例，經(jīng)產(chǎn)婦28例；年齡20～38歲，平 均（29.36±4.12）歲；孕 周31～39周，平 均（35.20±1.36）周。另選取同期在本院產(chǎn)檢的健康妊娠女性70例作為對照組。其中，初產(chǎn)婦45例，經(jīng)產(chǎn)婦25例；年齡20～37歲，平均（29.03±4.07）歲；孕周30～39周，平均（35.07±1.18）周。研究組中胎膜早破3例，胎兒窘迫4例，早產(chǎn)4例，將患者分為不良組與良好組，分別有11例和69例。兩組分娩經(jīng)歷、年齡、孕周等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究屬于前瞻性研究，且符合《赫爾辛基宣言》[8]。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準①符合《妊娠合并糖尿病診治指南（2014）》[7]診斷標準；②為妊娠期首次診斷；③無其他妊娠合并癥；④入組近1 周內(nèi)未使用過糖代謝藥物；⑤已簽署研究知情同意書。

1.2.2 排除標準①胎兒唐氏綜合征；②胎兒心臟發(fā)育異常；③胎兒宮內(nèi)發(fā)育受限或畸形。

1.3 方法

1.3.1 血糖及VEGF 水平檢測抽取受試者2 mL靜脈血，采用GLM-77 型血糖分析儀（上海益聯(lián)醫(yī)學儀器發(fā)展有限公司）測定患者空腹血糖（fasting blood glucose,FGB）、餐后2小時血糖（2 hour postprandial blood glucose,2 hPG）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）；另抽取受試者靜脈血3～4 mL，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，采用IAMMGE 特定蛋白分析儀（美國貝克曼公司）行酶聯(lián)免疫吸附試驗測定VEGF。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測miR-122 表達采集受試者外周靜脈血3～4 mL，3 000 r/min 離心5 min，取血清，置于混凝管中，加入miRNA Extractor 混勻分裝至EP管，置入-70℃冰箱冷凍保存。提取miRNA，取出樣本室溫下放置5～10 min，完全分離核酸與核蛋白，加入氯仿0.2 mL，震蕩30 s，12 000 r/min 離心15 min，吸取上層水相置于新的EP 管中，加入1/3 倍無水乙醇混勻，加入吸附柱中，12 000 r/min 離心10 min，收集穿流液到新的EP 管中，加入2/3 倍無水乙醇混勻，將全部溶液用轉(zhuǎn)液器加入吸附柱中，7 500 r/min 離心5 min，倒掉收集管中的廢液。再將吸附柱放回收集管，12 000 r/min 離心2 min，倒掉收集管中的廢液，再重復1 次。最后將吸附柱放回收集管，12 000 r/min離心2 min，置入新的EP管中，加入30 μL RNase-free水，12 000 r/min 離心2 min，棄吸附柱，保留流出液。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，離心管中加入各種反應成分，混勻12 000r/min 離心3～5 s，反應混合物應用TPfofessional Standard PCR 儀（德國Biometra公司）37℃溫浴60 min，85℃加熱5 min，使酶失活。qRT-PCR 反應中miR-122 的引物序列，正向引 物：5'-GCGGTCGACATGGTGGAATGTGGAGGTGA AG-3'，反向引物：5'-GGAATTCAAAAAAGATTGAG AAGACTGATATC-3'，均130bp。獲得cDNA樣本后，4℃保存。加入相應的樣本、試劑，加樣，應用實時熒光定量PCR 儀進行反應體系操作。數(shù)據(jù)采集應用2-ΔΔCt法。

1.3.3 隨訪自研究組在本院確診妊娠期糖尿病開始，以電話、微信、短信的形式進行隨訪，直至其結(jié)束妊娠。若參與者中途轉(zhuǎn)至其他醫(yī)院產(chǎn)檢，則隨訪終止。統(tǒng)計研究組胎膜早破、胎兒窘迫、早產(chǎn)等不良圍生兒結(jié)局的發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，比較用t檢驗；相關性分析用Pearson 法；繪制ROC 曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血糖水平比較

兩組血糖水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），研究組高于對照組。見表1。

表1 兩組血糖水平比較（）

表1 兩組血糖水平比較（）

2.2 兩組miR-122、VEGF比較

兩組miR-122、VEGF 比較，t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），研究組高于對照組。見表2。

表2 兩組miR-122、VEGF比較（）

表2 兩組miR-122、VEGF比較（）

2.3 GDM患者miR-122、VEGF與血糖的相關性

Pearson 相關性分析結(jié)果顯示，GDM 患者miR-122 與FGB、2hPG和HbA1c呈正相關（r=0.605、0.752 和0.542，均P=0.000），VEGF與FGB、2hPG和HbA1c呈正相關（r=0.532、0.623 和0.596，均P=0.000）。

2.4 不良組與良好組miR-122、VEGF比較

兩組miR-122、VEGF 比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），不良組高于良好組。見表3。

表3 不良組與良好組miR-122、VEGF比較（）

表3 不良組與良好組miR-122、VEGF比較（）

2.5 ROC曲線分析

ROC 曲線結(jié)果顯示，miR-122、VEGF 及兩者聯(lián)合檢測GDM 患者不良圍產(chǎn)兒結(jié)局的AUC 分別為0.787（95% CI：0.687，0.887）、0.755（95% CI：0.658，0.851）、0.842（95% CI：0.760，0.923）。miR-122 診斷GDM 患者不良圍生兒結(jié)局的敏感性、特異性為0.822（95% CI：0.792，0.911）和0.615（95% CI：0.560，0.741），VEGF 診斷GDM 患者不良圍生兒結(jié)局的敏感性、特異性為0.778（95% CI：0.645，0.874）和0.446（95% CI：0.382，0.576），兩者聯(lián)合檢測診斷GDM 患者不良圍生兒結(jié)局的敏感性、特異性為0.867（95% CI：0.802，0.937）和0.569（95% CI：0.464，0.664）。見表4 和圖1。

圖1 miR-122、VEGF及兩者聯(lián)合檢測預測GDM患者不良衛(wèi)生兒結(jié)局的ROC曲線

表4 miR-122、VEGF及兩者聯(lián)合檢測預測GDM患者不良衛(wèi)生兒結(jié)局的ROC曲線參數(shù)

3 討論

女性妊娠期間隨孕周的增加，體內(nèi)胎盤泌乳素、孕激素、催乳素等拮抗胰島素激素水平會顯著升高，使得胰島素敏感性降低。正常情況下，機體為維持正常的血糖代謝，會不斷分泌胰島素，而GDM 患者胰島素分泌受限無法完成代償，便會造成體內(nèi)血糖水平升高[9]。血糖的病理改變雖然不會給胎盤帶來特異性結(jié)構(gòu)的改變，但會影響許多形態(tài)上的變化，如胎盤細胞滋養(yǎng)層增生、絨毛小動脈增生、小血管管腔狹窄、滋養(yǎng)層基底膜變厚等，同時絨毛毛細血管過度充盈、毛細血管擴張，這一系列的變化是造成胎盤慢性缺氧及新生兒窒息、胎膜早破、胎兒窘迫等新生兒不良結(jié)局的主要原因[10]。此外，血糖的升高會使膽酸含量增多，引發(fā)肝內(nèi)膽汁淤積癥，提高子宮前列腺素水平，刺激子宮平滑肌催產(chǎn)素受體，引發(fā)嚴重宮縮，造成早產(chǎn)[11]。MUCHE等[12]研究指出，GDM 會增加新生兒不良結(jié)局的風險。因此，早期及時診斷GDM，采取救治措施對改善母嬰結(jié)局十分重要。

GDM 的胎盤滋養(yǎng)細胞的生存內(nèi)環(huán)境遭到破壞，細胞功能發(fā)生適應性改變，可誘導胎盤組織凋亡[13-14]。這一過程與胎盤組織的血供有密不可分的關系，而VEGF 因子是目前已知最強的血管生成因子之一。本研究結(jié)果顯示，研究組VEGF 水平高于對照組，初步推測血清VEGF 異常表達可能與GDM有關。分析原因可能在于：①胎盤血管密布及胎盤床血管內(nèi)皮損傷，可造成其血液灌注不足，血管活性物質(zhì)分泌失衡，最終會引起胎盤血氧供應缺失[15]；高血糖狀態(tài)下細胞無氧酵解增強，為適應高糖環(huán)境，糖酵解相關酶基因轉(zhuǎn)錄水平會發(fā)生改變，導致胎盤微血管的慢性缺氧[16]；③胎盤血管壁變厚，管腔狹窄，絨毛或部分絨毛發(fā)育不成熟，且絨毛毛細血管過分充盈，毛細血管擴張，從而導致胎盤微血管的慢性缺氧[17]。以上過程均會導致VEGF 表達異常升高，造成胎盤形成障礙，是引發(fā)早產(chǎn)及流產(chǎn)的重要原因。

miRNA 可以與靶基因mRNA3'端非編碼區(qū)互補結(jié)合，在翻譯水平或轉(zhuǎn)錄后參與基因的表達調(diào)控。如今miRNA 在高血脂、糖尿病等多種代謝疾病中的作用逐漸受到關注。ZHU等[18]在妊娠期糖尿病患者基因中獲得了184 個低miRNA 靶向上調(diào)基因和234 個高miRNA 靶向下調(diào)基因，另有67 個上調(diào)基因和48 個下調(diào)基因受到miRNA 異常交替的調(diào)控。DENG等[19]研 究指出，GDM 患者血清miR-29a/b 表達下調(diào)。ANJA等[20]研究指出，血清miR-16、miR-29a 和miR-134 在GDM 患者中呈高表達。禤文婷等[21]體外細胞實驗證實，軟脂酸誘導胰島素抵抗狀態(tài)下，miR-122 表達顯著上調(diào)，原因為miR-122 可通過下調(diào)AMPK基因表達，進一步加重胰島素抵抗程度。本研究結(jié)果顯示，研究組血清miR-122 表達高于對照組，提示GDM 患者miR-122 表達異常可能與胰島素抵抗有關。主要機制是通過上調(diào)二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2 基因和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1基因調(diào)節(jié)脂肪酸、低密度脂蛋白受體和膽固醇合成途徑，并催化甘油三酯類合成，從而參與胰島素抵抗調(diào)節(jié)。但也有研究得出不一樣的結(jié)論，F(xiàn)ORNES等[22]研究顯示，miR-122 的表達在妊娠期糖尿病大鼠及其雄性胎兒的血漿中下調(diào)，且miR-122 水平可通過體外過氧化物酶體增殖物激活受體γ 活化和體內(nèi)富含過氧化物酶體增殖物激活受體配體的母體飲食進行調(diào)節(jié)。鑒于miR-122 在GDM 患者中表達的相關研究較少，此結(jié)果還需日后擴大實驗范圍進一步獲取實驗數(shù)據(jù)。

綜上所述，GDM 患者血清miR-122、VEGF 均存在表達失調(diào)，兩者與血糖呈正相關，且兩者聯(lián)合檢測可有效預測不良圍生兒結(jié)局的發(fā)生。