加味參芪地黃湯干預內質網應激輔助治療糖尿病腎病的療效及對腎功能、糖脂代謝的影響*

張良，王丹，金艷紅，趙大鵬，李秀典，韓玉生

（黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院1.內科門診，2.腎內科，3.檢驗科，黑龍江 哈爾濱 150001；4.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院 腎內科，黑龍江 哈爾濱 150040；5.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱150001）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病患者常見的微血管并發癥之一，是終末期腎病的重要致病因素。既往調查顯示，我國糖尿病患病率＞10%，其中2 型糖尿病伴DN 患者占比接近40%[1]。形態學研究顯示，DN 患者腎小球高灌注狀態使細胞外基質堆積、系膜擴張、基底膜增厚，引發腎小管纖維化、腎小球硬化并伴結節性系膜病變，最終導致蛋白尿等嚴重腎功能損傷，需要依靠定期透析維持生命[2]。大量研究顯示，內質網應激（endoplasmic reticulum stress,ERS）通過調控多條未折疊蛋白反應信號通路，觸發自身免疫應答，促進DN 的發生、發展，可作為防治DN 的新靶點[3-4]。目前臨床多通過抑制患者體內腎素-血管緊張素-醛固酮系統阻止蛋白尿，以保護腎功能為主要治療思路。但DN 患者多合并多種慢性疾病，因此單純西藥治療的臨床效果并不十分理想[5]。隨著中西醫結合治療不斷發展，有臨床研究指出，中藥在DN 防治中具有一定的優勢。本文通過聯合加味參芪地黃湯輔助治療DN，觀察其臨床效果，并探究其對ERS的干預機制，期望為臨床防治DN提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年6 月—2021 年10 月黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院腎內科收治的DN 患者126例為研究對象，根據患者對治療方案的選擇分為研究組（79例）和對照組（47例）。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準①符合《中國2 型糖尿病防治指南（2013 年版）》[6]診斷標準：有明確糖尿病病史；隨機尿白蛋白/肌酐比值＞30 mg/g，或腎小球濾過率＜60 mL/（min·1.73 m2）3 個月以上，或腎穿刺活檢符合DN 病理改變；②中醫辨證符合《中醫內科學》[7]診斷標準，主癥：脾腎陰虛兼有氣虛，陰津虧耗、煩渴多飲、自汗盜汗、尿頻、消瘦；次癥：面色晄白，失眠心煩、舌質紅少津，苔少或花剝、脈數（細數或濡）；③患者及家屬知情并同意。

1.2.2 排除標準①合并嚴重的心、腦、肺及造血系統的嚴重疾?。虎诤喜乐氐哪[瘤、肝腎功能不全、藥源性蛋白尿等疾??；③合并嚴重精神疾?。虎苋焉锘虿溉槠趮D女；⑤基礎資料不全或依從性差；⑥對本研究使用藥物過敏。

1.3 治療方法

所有入組患者控制蛋白質及糖類攝入，戒煙、戒酒、控制體重，飲食及能量攝入參考《糖尿病腎病防治專家共識（2014 年版）》[8]相關標準。對照組患者給予以格列美脲[賽諾菲（北京）制藥有限公司生產，國藥準字H20057672] 2 mg/d，聯合伏格列波糖片（蘇州中化藥品工業有限公司，國藥準字H20093758）0.2 mg/次，三餐嚼服。研究組在上述基礎上聯合使用加味參芪地黃湯：黨參15 g、黃芪20 g、熟地15 g、山藥15 g、茯苓20 g、丹皮15 g、山茱萸15 g，生姜3 g、大棗5枚，每日2 次水煎劑，每劑50 mL，21 d為1 個療程。若患者有其他輔癥，則在基礎方劑上酌情加減。兩組患者均口服藥物治療5 個療程。

1.4 qRT-PCR檢測ERS相關指標

所有入組患者禁食8 h后，采集治療前及治療周期結束后（相對同一時間）次日清晨空腹靜脈血5 mL，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR）（PCR儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號：Quant Studio 3）分別檢測人內質網應激相關蛋白（human endoplasmic reticulum stress-related protein,CHOP）、活化轉錄因子6（activating transcription factor 6,ATF6）、分子伴侶葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78 ku,GRP78）mRNA 的表達。將采集的血液標本1 000 r/min 離心5 min 分離血漿，低溫保存待測。樣本加入TRIzol 提取總RNA 試劑盒（哈爾濱新?；驒z測有限公司，批號：B0132），并采用NanoDrop ND-1000 定量樣本中總RNA 質量?？俁NA 逆轉錄為cDNA（RT Master Mix for qPCR Ⅱ試劑盒購自美國Med Chem Express 公司），采用Primer Premier 5.0 軟件并根據目標miRNA 設計引物（內參U6），引物序列見表2。將配置好的PCR 反應溶液置于Real time PCR 儀上擴增（Power SYBR green 試劑盒購自大連寶生生物工程有限公司）。反應條件：93℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40 個循環，72℃繼續延伸7 min。根據擴增曲線及熔解曲線判斷qRT-PCR 反應質量，以2-ΔΔCt值為目的基因相對表達量。

表2 qRT-PCR引物序列

1.5 檢測血脂、血糖、腎功能等指標

采集所有入組患者治療前及治療周期結束后（相對同一時間）清晨靜脈血5 mL，采用全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特公司，AU5800）檢測血脂四項：甘油三酯（Triglyceride,TG）、總膽固醇（total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）；腎功能四項：血清肌酐（serum creatinine,Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、白蛋白（Albumin,Alb）、24 h 尿蛋白定量；血糖四項：空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、餐 后2 小時血糖（2 h postprandial blood glucose,2 hPBG）、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin,HbA1c）、空腹胰島素（fasting insulin,FINS）。計算穩態胰島素評價指數（homeostasis modeall assessment of insulin resistance,HOMA-IR），HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。采用酶聯免疫吸附試驗檢測血管緊張素（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）及血清Caspase-12 水平；觀察入組患者治療后不良反應發生情況。

1.6 療效診斷標準

參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[9]和《糖尿病及其并發癥中西醫診治學》[10]療效評判標準。①顯效：臨床癥狀基本消失，24 h 尿蛋白定量下降2/3 以上，Scr 下降1/4 以上；②有效：臨床癥狀及腎功能明顯改善（未及顯效標準），24 h 尿蛋白定量下降1/3 以上；③無效：臨床癥狀及腎功能未恢復或有加重傾向，各生化指標均未達標。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者治療前后血糖指標的變化

兩組治療前后血糖指標的差值比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），研究組HbA1c、FBG、2 hPBG、FINS、HOMA-IR 的差值大于對照組。見表3。

表3 兩組患者治療前后血糖指標的差值比較（）

表3 兩組患者治療前后血糖指標的差值比較（）

2.2 兩組患者治療前后血脂指標的變化

兩組治療前后血脂指標的差值比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），研究組TG、TC、LDL-C、HDL-C 的差值大于對照組。見表4。

表4 兩組患者治療前后血脂指標的差值比較（mmol/L，）

表4 兩組患者治療前后血脂指標的差值比較（mmol/L，）

2.3 兩組患者治療前后腎功能指標的變化

兩組治療前后腎功能指標的差值比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），研究組Scr、BUN、Alb、24 h 尿蛋白定量的差值大于對照組。見表5。

表5 兩組患者治療前后腎功能指標的差值比較（）

表5 兩組患者治療前后腎功能指標的差值比較（）

2.4 兩組患者治療前后ERS指標的變化

兩組治療前后ERS 指標的差值比較，經t檢驗，差異均有統計學意義（P＜0.05），研究組CHOP mRNA、ATF6 mRNA、GRP78 mRNA、AngⅡ、血清Caspase-12 的差值均大于對照組。見表6。

表6 兩組患者治療前后ERS指標的差值比較（）

表6 兩組患者治療前后ERS指標的差值比較（）

2.5 兩組患者臨床療效比較

研究組總有效率為87.34%，對照組為68.09%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.877，P=0.032），研究組高于對照組。見表7。

表7 兩組患者臨床療效比較例（%）

2.6 兩組患者不良反應發生情況比較

研究組不良反應總發生率為7.59%，對照組為27.66%，經χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=8.065，P=0.005），研究組低于對照組。見表8。

表8 兩組患者不良反應發生情況比較例（%）

3 討論

一項全國橫斷面調查結果顯示，我國成年男性糖尿病發病率為11.7%，女性為10.2%，40 歲以下患病率＞6%，總例數超過1億[11]。隨著糖尿病病例數的不斷攀升，其防治工作任重道遠。近年來隨著中醫技術不斷發展，中西醫結合在臨床治療中得到廣泛應用。傳統醫學對DN 并無記載，而多數學者將其歸類為“消渴癥”。中醫認為其病機為脾腎虧虛、腎精不封，水谷失于統攝，氣化不利，濁濕內蘊，繼而表現出身體消瘦或浮腫。而汪偉杜等[12]認為，DN 應由厥陰風動、疏泄太過所致。其研究指出，三焦之油膜發于腎，敷部其中元氣，通調水道；DN 患者因脾腎虧虛，以致中焦（膜）通道不疏，水火不濟，火性上炎，風火相煽，則表現出上焦口燥欲飲，下焦虛寒尿頻，使疾病整體呈現出寒熱虛實夾雜的特征[12]。現代中醫研究指出，焦膜與內質網在功能及結構上極為相似。

內質網是胞內囊腔、泡狀、管狀等結構的連續網膜系統，真核細胞≥1/3 的蛋白質均在內質網中合成、折疊、組裝及運輸，同時其通過監測細胞器內蛋白質的合成及降解過程，調節蛋白質穩態，保證胞內正常的生理功能[13-14]。在機體處于缺血、缺氧、氧化應激、內質網內鈣過量等多種病理環境下，均可打破內質網穩態，發生ERS 反應；ERS 通過激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response,UPR）等多條信號通路，啟動細胞保護機制，維持內質網穩態。然而長時間、高強度刺激UPR，可激活細胞損傷機制，引發細胞凋亡，導致疾病的發生、發展[15]。有研究指出，UPR 信號通路受GRP78、肌醇需求酶1、雙鏈RNA 依賴的蛋白激酶樣內質網激酶及ATF6 共同介導[16]。正常機體狀態下，上述4 個蛋白共同結合，處于失活穩態；當ERS 被過度/持續刺激后，促凋亡轉錄因子CHOP、血清Caspase-12 等被激活，進而啟動細胞凋亡程序[17]。有文獻顯示，高血糖、蛋白尿，以及晚期糖基化終產物、游離脂肪酸的增加均可激化ERS，觸發腎臟細胞內UPR信號通路[18]。基礎研究證實，與非糖尿病db/m小鼠比較，db/db 小鼠腎皮質中CHOP、Caspase-12 表達顯著上調[19]。另有研究指出，血管緊張素Ⅱ可通過誘導ERS 反應蛋白GRP78、CHOP 等的表達，調控多條信號通路，促進細胞凋亡，加重腎小球內皮細胞損傷。因此，近年來大量學者認為，針對ERS 靶點進行干預，或可成為治療DN 的新方法。本研究結果與上述研究基本一致，提示通過降低刺激ERS反應的相關基因與蛋白的表達，抑制UPR 啟動細胞凋亡程序，可降低機體損傷。

隨著中醫藥研究的不斷深入，在西藥單靶點、一對一的基礎上，中醫藥臨床呈現出的整體辨證治療、多層次、多靶點、多途徑的輔助優勢，得到臨床醫師廣泛肯定。本研究采用的參芪地黃湯，功在補脾腎，益氣養陰?，F代藥理證實，黨參能夠顯著增強網狀內皮系統及消化系統功能，促進白蛋白、血紅蛋白等合成，提高免疫力；黃芪可雙向調節血壓及糖代謝，維持血壓、血糖平衡，同時促進脾臟內粗面內質網增生，保護腎小球基底膜電荷屏障及機械屏障，增強蛋白合成率，提高血漿白蛋白水平，減少蛋白尿[20]；山藥可促進胰島素分泌，改善受損胰島B 細胞，并清除體內自由基，降低對ERS 的激活風險[21]；丹皮可改善機體微循環，促進肝腎組織細胞修復及再生；山茱萸可調節糖脂代謝，抗氧化、增強機體免疫力。諸藥合用，可促進肝、腎內皮修復，平衡糖脂代謝，促進腸胃消化吸收，消除蛋白尿，改善肝腎及整個機體功能。李春芳等[22]研究表示，參芪地黃湯可明顯改善2型糖尿病大鼠腎功能及腎臟病變，降低血清AngⅡ和腎組織內皮素水平，對腎臟有保護作用。朱勤等[23]研究結果則顯示，參芪地黃湯可保護阿霉素腎病大鼠Nephrin 蛋白表達，保護腎臟，減少蛋白尿。本研究結果顯示，研究組各指標的改善均明顯優于單純西藥治療的對照組，且總有效率更高，而不良反應更低。這在一定程度上說明，聯合用藥的治療方案可有效改善患者糖脂代謝，提高腎功能，對ERS 誘發的細胞凋亡程序具有明顯的抑制作用。

綜上所述，聯合加味參芪地黃湯對糖尿病腎病患者的臨床癥狀的改善、糖脂代謝及腎功能恢復效果更優，更有利于降低西藥治療帶來的不良反應，值得臨床推廣應用。