不同濃度鉛離子處理的雞腿菇菌絲生長表現

張思琪 馮馨儀 楊財容 羅智文 祁偉亮 劉松青

（成都師范學院化學與生命科學學院，四川 成都 611130）

雞腿菇（Coprinus comatus）又名毛頭鬼傘，隸屬真菌門、層菌綱、傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬。雞腿菇營養豐富，且可藥用，深受廣大消費者喜愛。由于食用菌栽培基質中的玉米芯、秸稈等在生長過程中會對土壤等栽培環境中的重金屬產生一定的吸附和轉化作用，而食用菌在生長發育過程吸收了這些原料中的重金屬，導致食用菌產品會涉及重金屬污染問題。此外，培養基質中所添加的石灰、過磷酸鈣等輔料中的重金屬通過食用菌的生長、轉化，也會富集到食用菌體內。在眾多重金屬污染中，鉛、砷、汞、鎘和鋁是食用菌中最常見的重金屬元素[1]。

一般來說，在食用菌生長過程中，其菌絲的生長周期相對較長，子實體的生長周期較短，因而吸收重金屬的主要途徑是通過菌絲吸收而非子實體。菌絲會通過被動運輸、主動運輸的方式吸收栽培環境中的重金屬，重金屬離子通過這些方式穿過細胞膜，進入細胞內部干擾、破壞食用菌的生理活性[2]。王松華等[3]報道靈芝菌絲在不同鎘（Cd）濃度處理下，菌絲鮮重及總糖、脯氨酸、還原糖含量與Cd濃度呈負相關，超氧化物歧化酶（SOD）活性與Cd 濃度呈正相關，過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）活性均呈現先上升后下降的變化趨勢。楊小紅等[4]研究在不同Pb、Cd、Hg、As 濃度處理下的平菇菌絲生長狀況和子實體產量，發現在較高濃度條件下，菌絲的生長狀況較差，生長速率減慢，子實體產量也顯著降低；且子實體富集重金屬的情況與環境中的重金屬濃度呈正相關關系。張琳[5]通過液體培養黃傘菌絲并且添加不同濃度的Mn2+、Pb2+，測定其各項生理指標及富集情況，結果表明當Pb2+和Mn2+濃度為700 mg/L 時，黃傘菌絲體內所含鉛和錳的量達到峰值。盧嬌嬌[2]發現不同銅（Cu）濃度對平菇菌絲生長的影響不同，低濃度下菌絲生長速度加快，濃度持續增加時，能明顯抑制菌絲生長；菌絲體內的抗氧化酶活性也發生變化。Liu 等[6]用重金屬處理食用菌，探究其抗氧化機制，發現食用菌體內的一些酶會受到影響，刺激體內分泌抗氧化酶來響應。熊曉斌等[7]研究不同濃度的鉛（Pb）、鎘（Cd）、汞（Hg）、砷（As）等重金屬對杏鮑菇和金針菇菌絲生長發育的影響，發現Pb、Cd、Hg、As 能夠不同程度地抑制這兩種菇的菌絲生長。

前人已研究重金屬脅迫對部分食用菌菌絲及子實體可能產生的影響，包括菌絲或子實體富集重金屬的能力及其生理變化等，不同食用菌菌絲在不同的重金屬環境中的生長狀況有所差別。食品安全國家標準GB7096—2014《食用菌及其制品》和食品安全國家標準GB2762—2012《食品中污染物限量》對食用菌及其制品的重金屬鉛（以Pb 計）的含量限定值為≤1.0 mg/kg。雞腿菇作為人們日常喜愛的食用菌之一，具有非常大的經濟價值。本文通過探究在不同Pb2+濃度下雞腿菇菌絲的生長速率及各項生理指標的變化，為人工栽培雞腿菇中的重金屬脅迫響應研究及重金屬控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

（1）菌種。雞腿菇（特大9201）一級種，購于江蘇省高郵市聯誼食用菌場。

（2）主要試劑。硝酸鉛、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、甲硫氨酸、氮藍四唑、EDTA-Na2、核黃素、創愈木酚、過氧化氫、高氯酸、硝酸。

（3）主要儀器和設備。高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫搖床、冷凍離心機、分光光度計、火焰原子吸收分光光度計。

1.2 試驗方法

（1）雞腿菇菌絲固體培養。配制PDA 固體培養基，高溫滅菌30 min，待稍冷卻后加入適量的已滅菌硝酸鉛母液，使培養基中Pb2+的濃度分別為0 mg/mL（對照）、5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL 和25 mg/mL，注入無菌培養皿中制成固體培養基。在超凈工作臺下，將供試菌種接種于培養基中心位置。將培養皿置于25 ℃恒溫培養箱內培養7 天，觀察菌絲生長狀況。每個處理3 次重復。

（2）雞腿菇菌絲液體培養。配置PDA 液體培養基，高溫滅菌30 min，冷卻后分裝至錐形瓶中，每瓶約100 mL。用已滅菌的直徑5 mm 打孔器在已活化的雞腿菇菌落中取菌種塊，接種至錐形瓶中，置于160 r/min、25 ℃恒溫搖床中培養5 天。在錐形瓶中添加標準硝酸鉛溶液，使Pb2+濃度分別為0 mg/L（對照）、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L和25 mg/L，每個處理3 次重復，置于25 ℃恒溫搖床中繼續培養2 天。培養完成后將其倒入離心管中，于4 ℃、10 000 r/min 下離心10 min，去上清液留取沉淀，然后將沉淀取出，用于制備粗酶液。

（3）菌絲生長速率測定。采用十字交叉法分別在1 天、7 天時測量菌落直徑并記錄，每個處理測定3 次，計算其平均值及菌絲生長速率。

（4）菌絲體鉛離子含量測定。依據食品安全國家標準 GB 5009.12—2010《食品中鉛的測定》方法測定。首先進行標準曲線的制作：吸取1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L 和40.0 mg/L的鉛標準液各10 μL，按照濃度從低到高依次進樣，測定其吸光值并制作標準曲線。然后采用濕法消解處理樣品，并通過火焰原子分光光度計測定其吸光值，計算結果。

（5）菌絲體丙二醛含量、抗氧化酶活性測定。參照李合生[8]著的《植物生理生化實驗原理和技術》測定菌絲中的丙二醛含量。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照Beauchamp 等[9]的氮藍四唑法；過氧化物酶（POD）活性測定參照Velikova 等[10]改進的愈創木酚法；過氧化氫酶（CAT）活性測定參照Aebi[11]的方法，測定240 nm 處的吸光值，計算其活性。

（6）數據分析及制圖。數據采用 IBM SPSS statistics 20 軟件進行分析，使用單因素方差分析法進行顯著性分析，用Pearson 法進行指標間相關性分析，所有數值均為3 次平行測定的算術平均值。采用Orgin 8.5 軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 不同Pb2+濃度處理的菌絲生長速率及長勢

雞腿菇菌絲經金屬鉛處理后，菌絲顏色以對照處理較白（圖1），生長速率隨培養基中Pb2+濃度增加呈現先上升后下降趨勢，當Pb2+濃度為10 mg/L 時，生長速率達到峰值，顯著快于其他處理（圖2）。說明培養基中低濃度Pb2+對菌絲生長有促進作用，但隨Pb2+濃度增加，雞腿菇菌絲生長逐漸受到抑制，濃度越大，受抑制越明顯。

圖1 不同Pb2+濃度處理的雞腿菇菌絲生長速率比較

圖2 不同Pb2+濃度處理的雞腿菇菌絲生長表現

2.2 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體鉛含量

制作的Pb2+標準曲線如圖3 所示。

圖3 Pb2+標準曲線

從圖4 可知，在培養基中加入不同含量的Pb2+標準溶液后，雞腿菇菌絲生長過程會吸收栽培環境中的Pb2+，導致菌絲體內鉛含量逐漸增加，且其鉛含量與環境中的Pb2+濃度呈正相關關系，當Pb2+濃度為25 mg/L 時，富集量達到最大值，為1.45 mg/kg，超過國家限量標準。而正是由于富集到的Pb2+越多，菌絲所受到的損傷就越大，遂使菌絲生長受到抑制。

圖4 雞腿菇菌絲對Pb2+的富集程度

2.3 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體丙二醛含量

丙二醛（MDA）含量能夠反映機體內的抗氧化狀況，如脂質過氧化速率及強度，也間接說明機體組織內的過氧化損傷程度[12]。由圖5 可知，隨著Pb2+濃度的增大，菌絲體內的MDA 含量先顯著上升，Pb2+濃度為20 mg/L時，達最大值0.73 μmol/L，是對照處理的2.6 倍；而后隨著Pb2+濃度的繼續增大，則MDA 含量開始下降。

圖5 雞腿菇菌絲在不同Pb2+濃度下的丙二醛含量

2.4 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體SOD 活性

當機體受到脅迫生成自由基時，其體內產生的超氧化物歧化酶（SOD）能將有害的自由基分解成對機體無害的O2和H2O，消除機體組織細胞的脂質過氧化狀況，減小細胞受到的損害，是酶促防御系統不可或缺的組成部分[13]。如圖6 所示，雞腿菇菌絲在遭到Pb2+脅迫時，菌絲受損傷，進而激活菌絲的一系列防御反應。當Pb2+濃度在0～10 mg/L時，SOD 活性增加較緩慢；當Pb2+濃度在15～20 mg/L 時，SOD 活性顯著提升，并在20 mg/L 濃度下達到最大值，說明在這一濃度區間，菌絲富集到更多的鉛，導致受到的氧化損傷逐漸加大，使得菌絲體內抗氧化酶SOD大量增加以抵御脅迫。當Pb2+濃度在25 mg/L 時，菌絲體SOD 活性降低，這可能是由于脅迫濃度高，導致酶活性降低。

圖6 雞腿菇菌絲在不同Pb2+濃度下的SOD 活性

2.5 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體POD 活性

生物體內含有多種還原劑，過氧化物酶（POD）能夠利用這些還原劑作為電子受體，以H2O2為底物，清除機體因受外界脅迫而產生的過氧化物，進而使生物體受到的損害顯著降低[14]。雞腿菇菌絲體中的POD 活性隨Pb2+濃度變化的趨勢與SOD 相似，當Pb2+濃度為20 mg/L 時，POD 活性達到最大值（圖7）。在菌絲受到逐漸加大的氧化損傷后，POD作為活性氧清除酶，也會增加其酶活來清除活性氧，減輕菌絲損傷；當Pb2+濃度過高時，POD 活性也會受到抑制。

圖7 雞腿菇菌絲在不同Pb2+濃度下的POD 活性

2.6 不同Pb2+濃度脅迫下的菌絲體CAT 活性

過氧化氫酶（CAT）和其他抗氧化酶類似，能夠清除機體內因環境脅迫所產生的過氧化氫（H2O2），使機體內H2O2大大減少，恢復較為良好的狀態[14]。雞腿菇菌絲體中的CAT活性隨著Pb2+濃度的增加呈先增加后降低趨勢，各處理差異顯著，當Pb2+濃度為10 mg/L時，CAT活性達到最大值（圖8）。與SOD、POD 的變化情況不同，CAT 活性的峰值在Pb2+濃度為10 mg/L 時即出現，隨后開始下降。其原因或許是因為CAT 是一種含有Fe3+的金屬酶，Pb2+處理后可能會取代Fe3+，或因自由基的積累間接引起CAT 空間構型的改變，導致CAT 活性下降[15]。

圖8 雞腿菇菌絲在不同Pb2+濃度下的CAT 活性

2.7 不同Pb2+濃度脅迫下菌絲體不同指標的相關性分析

當受到外界Pb2+脅迫時，雞腿菇菌絲體會產生形態、生理生化方面的變化，而這些變化之間具有一定的相關性。對受Pb2+脅迫后的雞腿菇菌絲體生長、Pb2+富集程度，以及與氧化相關的指標進行相關性分析的結果（表1），菌絲生長速率與Pb2+富集量及SOD 活性呈顯著負相關，這是由于Pb2+脅迫抑制了菌絲的生長，從而使得菌絲的防御性增強。菌絲體內的鉛含量與丙二醛含量及SOD、POD 活性呈極顯著正相關，這是因為菌絲富集到的Pb2+越多，受到的氧化損傷就越嚴重，從而會激活菌絲體內的抗氧化酶活性來進行防御。此外，丙二醛含量與SOD、POD、CAT 活性均呈現正相關關系，原因在于SOD、POD、CAT 是菌絲體內重要的活性氧清除酶，而丙二醛含量代表菌絲受到的氧化損傷程度，因此菌絲體在受氧化損傷大時需要激活這些防御酶來進行修復。

表1 Pb2+脅迫對雞腿菇菌絲的不同指標相關性分析

3 小結與討論

本研究結果顯示，在5～10 mg/L 低濃度Pb2+脅迫下，雞腿菇菌絲生長速率比對照快，當Pb2+濃度逐漸升高后，菌絲生長速率變慢，生長表現變差。菌絲體鉛含量與培養基中Pb2+濃度呈正相關，25 mg/L 時達到最大值為1.45 mg/kg，超過國家限量標準。經不同濃度Pb2+脅迫處理，菌絲體MDA含量及SOD、POD、CAT 的活性隨Pb2+濃度的增大呈先增后減趨勢。

本研究測定了雞腿菇在不同Pb2+濃度處理后菌絲生長速率以及生理指標的變化趨勢，結果發現菌絲生長速率在低Pb2+濃度下得到促進，這一結果與胡清秀等[16]報道的低銅條件能促進杏鮑菇菌絲生長，表現菌絲粗壯、顏色潔白的結論相似。可能的原因是菌絲受到外界環境輕微刺激時，會提高自身的生活力來抵御逆境，表現出生長旺盛的現象；而刺激濃度繼續提高則會抑制菌絲的生長。

在前人的研究中，隨著Pb2+、Mn2+濃度的升高，均會增加黃傘菌絲體SOD、CAT、POD 的活性，在金屬離子達到一定濃度時，這些抗氧化酶活性則會下降[5]。不同濃度重金屬鎘處理的靈芝菌絲[3]、不同濃度鎘和鉛處理的長根菇菌絲[17]，其試驗結果均表現菌絲體內的抗氧化酶活性隨著金屬離子濃度增加而先增加、達到最大值后開始下降，與本研究結果一致。

另有學者研究了真姬菇、雙孢蘑菇、黑木耳、平菇、白靈菇5 種食用菌菌絲對環境中的鉛、鎘、汞、砷等重金屬的富集情況，結果顯示這5 種食用菌菌絲所含重金屬的量均隨著環境重金屬濃度的增加呈現先增加，而后增速減慢，最終達到相對穩定的趨勢[18]。本試驗中隨著外界Pb2+濃度的增加，雞腿菇菌絲體內富集的金屬鉛含量也逐漸增加，但并未達到最大值，出現這種差異的可能原因是本試驗所設Pb2+濃度最大只到25 mg/L，可能尚未達到菌絲所能承受的最大限度，未來可做進一步研究。

隨著生活品位的不斷提升，人們對食用菌的品質要求越來越高。目前關于包括雞腿菇在內的食用菌栽培技術、開發應用等的研究已有很多，但有關食用菌對重金屬的吸附機制方面的研究還較少。本研究對不同濃度鉛離子處理的雞腿菇菌絲體丙二醇含量、抗氧化酶系統和鉛富集量等指標進行測定的結果，可為雞腿菇重金屬脅迫研究提供一些基礎數據。研究中發現，當栽培環境中Pb2+濃度達到25 mg/L 時，雞腿菇菌絲體的含鉛量超出了國家限定標準，不符合食品安全要求。這一結果可為控制環境中重金屬含量，保障食品安全提供重要參考。但本試驗只選取了一個雞腿菇品種為對象，而未對其他雞腿菇品種開展相關試驗，并且未涉及對子實體的影響相關研究，具有一定的局限性，尚需進一步深入研究。