側(cè)孢芽孢桿菌對(duì)鋅尾礦先鋒植物富集Zn、Cd能力的影響

李圓圓，郝 喆，孫 杰

(遼寧大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

0 引 言

近年來，由于礦產(chǎn)資源逐漸枯竭或礦山政策性關(guān)停等原因，形成了大量責(zé)任主體缺失的廢棄尾礦庫。這些廢棄尾礦庫由于缺乏有效的監(jiān)管措施與管理制度，生態(tài)環(huán)境問題十分突出。廢棄尾礦砂中的大量重金屬在地表徑流或雨水淋濾作用下，污染周邊土壤[1]。修復(fù)受污染土壤的方法主要有穩(wěn)定化修復(fù)、提取法、加熱解析法、生物炭改良劑等，這些方法具有成本高、易造成二次污染等缺點(diǎn)，因此不適用于大范圍的土壤修復(fù)，而植物修復(fù)成本低、無二次污染，可用于大范圍尾礦庫的生態(tài)修復(fù)。

國內(nèi)外諸多學(xué)者在植物修復(fù)重金屬污染土壤方面做了一系列研究。李凱俊[2]等對(duì)南京鉛鋅礦區(qū)土壤重金屬及其主要植物的生物富集作用進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示14種先鋒植物均具有耐金屬性，可用于生態(tài)修復(fù)；Samaneh Torbati[3]等研究了生長在伊朗濕地的3種植物對(duì)重金屬的生物富集作用，證明植物香蒲能在根部積累大量的Cd、Zn、Pb，根系元素富集系數(shù)大于1；劉秉浩等[4]利用外生菌根樟子松對(duì)廢棄尾礦池進(jìn)行植物修復(fù)，實(shí)驗(yàn)表明含外生菌根的樟子松明顯富集更多的Zn、Cd、Pd；T Pardo[5]等將赤泥衍生物與堆肥的混合物以及熟石灰混合播撒于田地中，然后將尾礦土壤原封不動(dòng)地轉(zhuǎn)移并混合到植物生長的田地中，并播種了濱藜和短葉霸王，證明結(jié)合使用赤泥衍生物，堆肥和鹽生植物是一種良好的植物穩(wěn)定策略；程剛?cè)蔥6]等評(píng)估了豆科植物、根瘤菌和叢枝菌根真菌(AMF)在鈾污染土壤復(fù)墾中的共生關(guān)系，結(jié)果表明，AMF和根瘤菌在三重共生中具有互利關(guān)系，從而顯著增加了植物的生物量和鈾積累。上述研究均可以證明野外植物在添加菌劑或者其他試劑后，提升了植物富集尾礦庫土壤中的重金屬Zn、Cd的能力，而不同植物富集重金屬的能力也有所不同。此外，有些研究者對(duì)微生物菌修復(fù)重金屬污染土壤也有一定的研究。崔兆杰、張旭[7]等研究證明復(fù)合微生物菌劑對(duì)重金屬的固定化效率高達(dá)74.98%(Zn)、85.29%(Pb)和79.41%(Mn)，顯示出較好的生物修復(fù)效果；Sami Ullah Jan[8]等研究表明金屬抗性芽孢桿菌組合提高了歐洲油菜在污染土壤中的重金屬富集效率；Edward Raja Chellaiah[9]通過研究發(fā)現(xiàn)，生物觸媒劑銅綠假單胞菌不僅可以對(duì)促進(jìn)植物生長，還可以提高植物對(duì)重金屬Cd的吸附能力。

目前，對(duì)植物和微生物聯(lián)合修復(fù)土壤重金屬污染的研究大多限于盆栽小試階段，缺乏直接應(yīng)用于野外尾礦土壤的試驗(yàn)研究，并且對(duì)所選富集植物種類的研究較少。文章選用郴州柿竹園廢棄鋅尾礦庫上生長的小蓬草(Conyzacanadensis(Linn.)Cronq)、腎蕨(Nephrolepisauriculata(L.)Trimen)、長芒草(StipabungeanaTrin)、小蓼(PolygonimminusHuds)4種先鋒植物作為研究對(duì)象，進(jìn)行野外實(shí)驗(yàn)，通過向4種植物的根際土壤中加入不同劑量的側(cè)孢芽孢桿菌菌劑，培養(yǎng)期結(jié)束后分別測(cè)定植物地上部分、地下部分及植物根系周圍土壤中的Zn、Cd含量，分析不同菌劑用量對(duì)植物吸附重金屬Zn、Cd的影響，以期為修復(fù)尾礦土中重金屬污染工作提供重要理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)及分析方法

1.1 野外試驗(yàn)布置

試驗(yàn)場(chǎng)地位于湖南省郴州市柿竹園有色金屬有限責(zé)任公司的廢棄鋅尾礦庫。調(diào)研表示：鋅尾礦庫采樣點(diǎn)為pH≤6的酸性土壤，且該尾礦庫土壤中重金屬Zn2+、Cd2+的變化范圍較廣，分別為598.05～2 156.45 mg/kg和23.60～42.95 mg/kg。

(1)在礦區(qū)采用五點(diǎn)取樣法，選擇高度、生長年齡相近的腎蕨、長芒草、小蓬草、小蓼4種現(xiàn)場(chǎng)自然生長的植物，每種植物采3株，植物照片如圖1所示。為減少傷根在移植前一天澆水潤濕根部土壤，用小工具扒開植物根系外圍，然后用小鏟垂直用力鏟下，為避免破壞根系主根完整性，挖掘土壤深度為35 cm。

(2)在尾礦庫中央選擇一塊陽光適宜的空地(4 m×1 m)，挖4個(gè)間隔40 cm的長方形溝渠(40 cm×85 cm×40 cm)，將之前移出的植物放入溝渠中，每個(gè)溝渠放4種植物，每種植物放3株，豎直排放，從后至前依次為：小蓬草、小蓼、腎蕨、長芒草，每種植物根系間距約為20 cm，用挖出的深層土壤進(jìn)行填埋。植物布局如圖2所示。

(3)選用蘸根、灌根結(jié)合的方式，將側(cè)孢芽孢桿菌菌劑用少量清水稀釋[10]，把移栽植物的根部浸入到稀釋溶液中，使其充分沾上菌液，之后按照劑量對(duì)其進(jìn)行灌根培土。期間每2個(gè)月向土壤中均勻加入5、10、20、30 g劑量的側(cè)孢芽孢桿菌菌劑。

圖1 4種先鋒植物照片F(xiàn)ig.1 Photos of four pioneer plants

圖2 植物布局示意圖Fig.2 Schematic diagram of plant layout

1.2 試驗(yàn)方法

對(duì)土壤用前述方式維護(hù)6個(gè)月后采集實(shí)驗(yàn)區(qū)植物地下部位、地上部位和根部土壤樣品，進(jìn)行樣品前處理。

(1)植物

植物的清洗：將所挖出的植物用自來水小流量沖洗，保證植物的完整性，并無土壤殘留，然后再用蒸餾水淋洗一遍，用吹風(fēng)筒距離15 cm將植物吹干，不滴水即可，最后將其放在對(duì)應(yīng)編號(hào)的密封袋中。

植物的烘干：將清洗后植物放入烘箱中烘至恒重，再將植物根和露出土壤部分分開，分別將其磨碎，倒出后研磨成粉狀，放入編號(hào)的封裝袋中，于干燥器中保存[11]。

植物的消解：分別精確稱取0.200 0 g4種植物的地上樣品和地下樣品放入100 mL的三角瓶中，加入5 mLHNO3、1 mLH2O2搖勻，靜置1夜。樣品封口后置于微波消解器中，按表2的微波消解條件其消解完全后，將消解好的溶液倒入100 mL的容量瓶中，滴加2%的硝酸進(jìn)行定容，倒入廣口瓶待測(cè)。

(2)土壤

土壤的烘干：將土壤分批放入烘箱中，控制溫度在60～70 ℃，干燥12 h，放入編號(hào)的封裝袋中，于干燥器中保存。

土壤的消解：將處理好的土壤樣品放入三角瓶中，先用去離子水潤濕，再加入5 mLHNO3、1 mLH2O2搖勻，靜置1夜。待土壤樣品完全消解后，將溶液倒入100 mL的容量瓶，滴加2%的硝酸進(jìn)行定容，倒入廣口瓶中密封保存待測(cè)。

表1 微波消解條件

重金屬測(cè)定：采用原子吸收光譜法分別測(cè)定植物粉末和土壤粉末中重金屬Zn、Cd含量。

1.3 分析方法

選用富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)來進(jìn)行分析，二者能最直觀地反映出植物富集重金屬Zn、Cd的能力。對(duì)于一個(gè)受污染的生態(tài)系統(tǒng)而言，處于不同營養(yǎng)級(jí)的生物對(duì)污染物的富集能力不同，這兩者可以明確反映出不同植物在側(cè)孢芽孢桿菌作用下富集重金屬Zn、Cd的影響。

富集系數(shù)(Enrichment Factor, EF)是樣品中元素的濃度與背景中元素的濃度的比值，以此判斷環(huán)境介質(zhì)中元素的污染狀況。簡(jiǎn)言之就是單位質(zhì)量的生物量富集的污染物含量。由式(1)可計(jì)算富集系數(shù)EF。

(1)

式(1)中：Ci/Cnsediment是土壤中金屬i與標(biāo)準(zhǔn)化元素n的測(cè)定含量比，Ci/Cnbackground是土壤中金屬i與標(biāo)準(zhǔn)化元素n的背景值含量比。

重金屬轉(zhuǎn)移系數(shù)是指植物露出土壤部分的重金屬含量與土壤地下根際中重金屬含量的比，是用來評(píng)價(jià)植物將重金屬從露出土壤部分向地下運(yùn)輸和富集能力的一種指標(biāo)，用TF表示。TF值越高表明植物露出土壤部分的重金屬富集量越大，越適用于植物修復(fù)技術(shù)。由式(2)可計(jì)算轉(zhuǎn)移系數(shù)TF。

(2)

式(2)中：S植物地上部分某種重金屬元素含量，g/mol；R植物地下部分該種元素的含量，g/mol。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物富集系數(shù)與菌劑用量的關(guān)系

試驗(yàn)考察了菌劑劑量分別為0、5、10、20、30 g時(shí)4種先鋒植物對(duì)重金屬Zn、Cd的富集系數(shù)，圖3為植物富集系數(shù)和菌劑用量的關(guān)系。

圖3 植物富集系數(shù)和菌劑用量關(guān)系圖Fig.3 Relationship between the plant enrichment coefficient and bacterial agent consumption

由圖3可知，添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后，先鋒植物小蓬草對(duì)土壤重金屬Zn的富集系數(shù)Zn大于Cd。當(dāng)菌劑劑量達(dá)到20 g時(shí)，小蓬草富集土壤中的重金屬Zn的能力達(dá)到峰值1.8；隨著菌劑劑量的增大，添加30 g側(cè)孢芽孢桿菌菌劑時(shí)，小蓬草富集重金屬Zn的能力下降。

當(dāng)添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后，先鋒植物長芒草對(duì)土壤重金屬Cd的富集系數(shù)大于Zn。當(dāng)菌劑劑量達(dá)到5 g時(shí)，長芒草富集土壤中的重金屬Cd能力達(dá)到峰值1.3；添加菌劑劑量在5～30 g時(shí)，長芒草富集土壤中重金屬Cd的能力呈下降趨勢(shì)；添加菌劑達(dá)到30 g時(shí)，對(duì)長芒草富集重金屬Cd的能力基本沒有影響。

對(duì)比先鋒植物腎蕨添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后對(duì)2種重金屬的富集系數(shù)，可以明顯看出菌劑對(duì)腎蕨富集重金屬Zn的能力影響甚微。隨著菌劑添加量的不斷加大，腎蕨富集重金屬Cd的能力迅速下降，當(dāng)菌劑添加量達(dá)到30 g時(shí)，富集系數(shù)甚至下降到未添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑時(shí)的1/4。

先鋒植物小蓼對(duì)重金屬Zn的富集能力在添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑為10 g時(shí)達(dá)到峰值。隨著菌劑劑量的增大，小蓼的富集系數(shù)逐漸趨于未添加菌劑時(shí)的富集系數(shù)，這表明添加菌劑劑量在20～30 g時(shí)，不會(huì)提高小蓼對(duì)Zn的富集能力；此外，由圖3(b)可以看出，添加菌劑后，小蓼吸附重金屬Zn、Cd的能力從初始值0.96下降到0.2，但在添加菌劑為20 g時(shí)富集系數(shù)突然上升接近初始值0.96，證明施加菌劑后，小蓼吸附重金屬Zn、Cd的能力沒有得到改善，反而下降。

2.2 植物轉(zhuǎn)移系數(shù)與菌劑用量關(guān)系

試驗(yàn)考察了菌劑劑量分別為0、5、10、20、30 g時(shí)4種先鋒植物對(duì)重金屬Zn、Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)，圖4為植物轉(zhuǎn)移系數(shù)和菌劑用量的關(guān)系。

由圖4(a)可知，添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后，先鋒植物小蓬草對(duì)土壤重金屬Zn的轉(zhuǎn)移系數(shù)大于Cd。隨著菌劑劑量逐漸增大，小蓬草轉(zhuǎn)移重金屬Zn的能力逐漸上升。當(dāng)菌劑劑量達(dá)到30 g時(shí)，小蓬草轉(zhuǎn)移土壤中的重金屬Zn的能力達(dá)到峰值0.96。

當(dāng)添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后，添加劑量低于20 g時(shí)，先鋒植物長芒草對(duì)土壤重金屬Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)大于Zn。當(dāng)菌劑劑量達(dá)到20 g時(shí)，長芒草富集土壤中的重金屬Cd能力達(dá)到峰值1.04；添加菌劑達(dá)到30 g時(shí)，長芒草轉(zhuǎn)移重金屬Cd的能力下降為0.32。

圖4 植物轉(zhuǎn)移系數(shù)和菌劑用量關(guān)系圖Fig.4 Relationship between the plant transfer coefficient and bacterial agent consumption

對(duì)比先鋒植物腎蕨添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后對(duì)2種重金屬的轉(zhuǎn)移系數(shù)，可以明顯看出腎蕨轉(zhuǎn)移重金屬Cd的能力在添加菌劑達(dá)到10 g時(shí)提升效果最顯著。當(dāng)菌劑添加量達(dá)到10 g時(shí)，轉(zhuǎn)移系數(shù)達(dá)到最高的1.5；隨著菌劑添加量的提升，達(dá)到30 g時(shí)，轉(zhuǎn)移系數(shù)下降至0.4。

先鋒植物小蓼對(duì)重金屬Zn的轉(zhuǎn)移能力在添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑為10 g時(shí)達(dá)到峰值。隨著菌劑劑量的增大，小蓼的富集系數(shù)逐漸趨于未添加菌劑時(shí)的富集系數(shù)，這表明添加菌劑劑量在20～30 g時(shí)，提高小蓼對(duì)Zn的轉(zhuǎn)移能力較弱；此外，由圖4(b)可以看出，添加菌劑后，小蓼側(cè)孢芽孢桿菌菌劑的存在明顯增強(qiáng)了小蓼轉(zhuǎn)移Cd的能力，相較于未添加菌劑的0.11，添加菌劑劑量在5～30 g 時(shí)，轉(zhuǎn)移系數(shù)達(dá)到了原來的4～6倍。

3 結(jié) 論

通過加入不同劑量側(cè)孢芽孢桿菌菌劑對(duì)柿竹園鋅尾礦先鋒植物進(jìn)行野外移植，測(cè)定植物地上部分、地下部分及植物根系周圍土壤中的Zn、Cd含量，分析不同劑量菌劑作用下植物對(duì)Zn、Cd的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)影響的關(guān)系，結(jié)論如下：

(1)添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后，小蓬草對(duì)重金屬Zn的富集系數(shù)大于Cd；長芒草對(duì)重金屬Cd的富集系數(shù)大于Zn，隨著劑量的增大，小蓬草和長芒草對(duì)重金屬Cd的富集系數(shù)先增大后減小。

(2)添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后，腎蕨富集重金屬Zn的能力幾乎不變，隨著菌劑劑量的增大，腎蕨富集重金屬Cd的能力下降；小蓼富集重金屬Zn的能力添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑為10 g時(shí)達(dá)到峰值1.61，富集重金屬Cd的能力下降。

(3)添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后，小蓬草對(duì)重金屬Zn的轉(zhuǎn)移系數(shù)大于Cd；添加劑量達(dá)到20 g之前，長芒草對(duì)重金屬Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)大于Zn，隨著菌劑劑量的增大，長芒草對(duì)重金屬Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)先增大后減小最后趨于穩(wěn)定。

(4)添加側(cè)孢芽孢桿菌菌劑后，在添加菌劑達(dá)到10 g 時(shí)，腎蕨轉(zhuǎn)移重金屬Cd的能力提升效果顯著，而其他4種劑量則影響微弱；添加菌劑后，小蓼轉(zhuǎn)移Cd的能力較未添加菌劑明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)移系數(shù)達(dá)到了原來的4～6倍。

(5)4種先鋒植物除了小蓼之外，其他3種在施加10～20 g側(cè)孢芽孢桿菌菌劑時(shí)，對(duì)土壤中重金屬的富集能力較強(qiáng)。小蓬草、腎蕨、長芒草Zn的轉(zhuǎn)移系數(shù)分別為0.96、0.82、0.67，而3種植物Cd的轉(zhuǎn)移系數(shù)依次為0.6、1.5、1.04。這4種植物中腎蕨對(duì)菌劑劑量最敏感。富集轉(zhuǎn)移重金屬Zn、Cd能力排序?yàn)椋耗I蕨>小蓼>長芒草>小蓬草。