電紡漆酶催化降解水中雙酚A性能研究

趙 鑫，馬桂敏，尹 娟，王正川，李赫龍，徐 強

(1. 深圳市廣匯源環境水務有限公司，廣東 深圳 518011；2. 廣東省城市水環境與水務信息化工程技術研究中心，廣東 深圳 518011)

0 引 言

雙酚A(Bisphenol A，BPA)，即2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷，是一種具有內分泌干擾性的類雌性激素，屬于難揮發、疏水性有機污染物[1]。BPA被廣泛應用于制造聚碳酸酯、環氧樹脂等高分子材料，也可用于生產粘合劑、抗老化劑、粉末涂料等工業制品。由于應用廣泛，BPA可通過多種途徑進入水體，污染地表水和地下水。BPA對脊椎動物具有激動雌激素受體的作用，可誘導脊椎產生前凸反應，引起假早熟[2]；對于兩棲類動物，可引發性逆轉；對于哺乳動物，則會導致子代變異效應，如子代的畸形、死胎、體重下降、肝多核細胞增加及纖維性骨萎縮等現象。BPA進入人體內后會干擾體內正常激素的分泌，從而影響生殖功能，導致惡性腫瘤的產生[3-4]。

漆酶可以用于降解水中BPA。漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是含有4個銅離子的多酚氧化酶，能催化多種芳香族化合物，如各種酚類染料、氯酚、硫酚、多氯聯酚、BPA、芳香胺、殺蟲劑等的降解，可與之作用的底物相當廣泛[5]。與直接利用微生物的水處理技術相比，酶催化反應本身具有分解效率高、毒性小、操作簡便、使用范圍寬的優點。然而，由于漆酶本身易溶于水、不可重復使用、容易變性失活、價格偏高，使它在實際中的應用受到了限制，而通過酶的固定化技術，則可以實現酶的重復連續使用。漆酶的固定化是指將水溶性漆酶以物理或化學的方法固定在有機或無機的載體上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物，使其仍具有催化活性，并可回收及重復使用的方法與技術[6-7]。與游離酶相比，固定化漆酶易從反應體系中分離出來，可以重復使用，提高酶的化學穩定性，能夠嚴格控制酶反應過程，同時易從使用環境中分離，提高了酶的使用效率，降低其使用成本[8]。

本研究采用靜電紡絲纖維膜作為漆酶固定化的載體，利用包埋法固定化漆酶。借助靜電紡絲包埋漆酶，形成核-殼結構載酶納米纖維，先在聚合物溶液中加入一定量的表面活性劑，再加入酶溶液混合形成均勻的乳液，然后將乳液引入靜電紡絲裝置中進行電紡，從而得到載酶纖維膜[9]。本研究重點考察了載酶纖維膜的催化活性和穩定性，評價了其在降解模擬地表水中BPA的過程中的實際應用價值。

1 實驗方法

1.1 紡絲液和游離漆酶溶液的制備

稱取1.8 g聚乳酸-乙醇酸共聚物(PDLGA)，0.2 g 嵌段聚醚F108和20 g二氯甲烷，經磁力攪拌器震蕩2 h，至充分溶解即制成紡絲液。其中，加入與聚合物PDLGA質量比為10%的F108作為乳化劑。使用超純水制備漆酶(真菌漆酶，CAS 80498-15-3，西寶生物科技，在30 ℃、pH 6.5、3 mL反應體積中，以丁香醛連氮為底物時，1個單位每分鐘將產生的Δa530為0.001)溶液，將漆酶與超純水按照一定比例混合，經過震蕩使之充分溶解，分別制成5 mg/L和15 mg/L的漆酶水溶液。漆酶溶液現配現用，以防止酶失活。5 mg/L漆酶溶液用于做游離漆酶降解實驗，15 mg/L漆酶溶液則用于制備載酶電紡纖維膜。

1.2 漆酶的固定化和電紡纖維膜制備

按照上述步驟制備紡絲液后，在紡絲液中加入0.5 mL、15 mg/L的漆酶溶液充分震蕩混合形成均勻溶液，即制成載漆酶紡絲液。將0.5 mL漆酶溶液替換為0.5 mL超純水按同樣方法震蕩混合制成空白膜紡絲液。載漆酶紡絲液現配現用。

乳液電紡的步驟如圖1所示，使用的裝置是自制的靜電紡絲裝置，由直流高壓電源、噴絲頭和接收裝置組成。靜電紡絲采用20 kV高壓電場，紡絲液噴射針尖及收集器之間的距離為15 cm。使用塑料滴管手動將紡絲液引入紡絲容器中，調節各參數獲得穩定連續的噴射，噴射出的纖維用鋁箔紙進行收集。在紡織載酶膜時注意避光。待纖維膜厚度達到0.5～1.0 mm時，停止紡絲。一般情況下，紡一張足夠厚的膜需要40 min。紡織完成的膜放置在干燥避光處待其晾干。空白膜可儲存在4 ℃的條件下以備下次試驗使用，載酶膜須現紡現用，防止酶失活。

圖1 乳液電紡流程圖Fig.1 Flow chart of emulsion electrospinning

1.3 電紡纖維膜形態結構的表征

固定化漆酶電紡纖維膜的形態特征采用場發射掃描電子顯微鏡(FESEM S-4800，Hitachi)來觀察表征。在靜電紡絲過程中，電紡纖維用激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM LSM510,ZEISS)觀察。固定化漆酶電紡纖維膜的比表面積和孔體積的測定采用是比表面孔分布測定儀(ASAP2020,Micromerities)。為了驗證漆酶是否已經被包埋入電紡纖維之中，使用配制好的紡絲液加入等量的未作標記的漆酶溶液和用異硫氰酸熒光素(FITC)標記的漆酶溶液分別進行靜電紡絲，靜電紡絲之后均在激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)下觀察其包埋情況[10]。

1.4 游離漆酶及電紡纖維膜固定化漆酶酶活性的測定

通過紫外可見分光光度計測定漆酶催化氧化2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)過程中的吸光度變化來確定漆酶活性，測量波長為420 nm[11]。游離漆酶和電紡纖維膜固定化漆酶的酶活穩定性和持久性通過30 d的連續測定得到，在此期間，游離漆酶及固定化漆酶樣品均在4 ℃下，儲存在pH為3.5的磷酸鹽緩沖溶液中。為了減小實驗誤差，每次實驗之前電紡纖維膜均經磷酸鹽緩沖液淋洗3次，再與ABTS溶液反應。每個反應重復10次。

1.5 游離漆酶和固定化漆酶對水中雙酚A的降解實驗

分別量取0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 mL 的1 000 mg/L BPA標準液于100 mL容量瓶中，定容，配制成為100 μg/L、500 μg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L的BPA水溶液。稱取一定量漆酶固體與超純水混合，震蕩至完全溶解，形成5 mg/mL的漆酶溶液。每個反應瓶中加入30 mL不同濃度的BPA水溶液和20 μL、5 mg/L的漆酶溶液，每個濃度各設置3組平行樣。將反應器放入恒溫振蕩箱中進行反應，振蕩箱溫度設置為25 ℃，轉速設為160 r/min。取樣時間為5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、1.5 h、2 h。從每個反應器中吸取等體積的反應液置于液相色譜進樣瓶中，每個樣品取完后立即加入20 μL、0.1 mol/L的NaN3溶液，以抑制酶活性。

按上述步驟，將游離漆酶降解BPA實驗中加入的20 μL、5 mg/L漆酶溶液替換為3片經裁剪稱量完畢的載酶膜即為固定化漆酶降解BPA實驗。

1.6 不同溫度下游離酶和固定化漆酶對雙酚A的降解實驗

采用濃度為5 mg/L的BPA溶液進行實驗，首先量取一定量1 000 mg/L的BPA標準液與超純水混合，配制5 mg/L的BPA水溶液。每個反應器中加入30 mL配制完畢的BPA水溶液，并加入20 μL、5 mg/L的漆酶溶液。將反應器放置于恒溫振蕩箱中分批次進行反應，箱內溫度分別設為5、15、35、45 ℃，轉速均設為160 r/min，取樣時間及樣品保存方法同上。進一步地，按上述步驟，將游離漆酶溶液替換為3片經裁剪稱量完畢的載酶膜即為不同溫度下固定化漆酶對BPA的降解實驗。

1.7 水中雙酚A的濃度檢測

采用高效液相色譜(HPLC，Waters 1525)測定BPA濃度，檢測器為UV(Dual λ Absorbance Detector，Waters 2487)，C18反向液相色譜柱為，流動相體積比為乙酸水溶液∶無水甲醇=2∶8，檢測波長為280 nm，流速為1 mL/min，進樣量為10 μL。

2 結果與討論

2.1 電紡纖維膜形貌的表征

運用靜電紡絲技術能夠使水-油型(W/O型)或油-水型(O/W型)乳液形成核-殼結構纖維[12]，作為水相的漆酶可以直接包埋進入電紡纖維的核心，并且核-殼結構纖維能夠有效保護包埋入的蛋白質，使其保持結構完整性和生物活性[13]。

圖2 電紡纖維的SEM圖Fig.2 SEM diagrams of electrospun fibers

圖2為放大100、2 000、10 000、22 000倍后，在場發射掃描電子顯微鏡(SEM)下電紡纖維的照片。從圖中可以看出，電紡納米纖維膜形態類似無紡布，纖維成無序狀態排列。增大放大倍數之后，可以清晰地看到，每一根電紡納米纖維表面均疏松多孔，孔隙率高，與一般的超細纖維相比，具有更大的比表面積，有利于反應底物的附著和反應的進行。

圖3為用經FITC標記的載酶紡絲液靜電紡絲后得到的電紡納米纖維膜在激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)下的照片。圖中電紡纖維內部有帶紅色熒光的部分，即為帶FITC標記的漆酶。如圖3可知，漆酶溶液已經成功包埋于電紡納米纖維之中，形成殼-核結構。

圖3 經FITC標記的載酶電紡納米纖維膜激光共聚焦掃描顯微鏡照片Fig.3 Confocal scanning microscopy images of FITC-labeledenzyme-loaded electrospun nanofiber membranes

相比一般方法制備的纖維膜，通過靜電紡絲獲得的超細纖維膜具有極大的比表面積和多孔結構，有利于提高反應底物對漆酶的結合位點的傳輸速率，以及其優越的機械性能，使得超細纖維膜易從反應液中恢復，可二次使用。同時，靜電紡絲制備纖維膜操作簡單，制備成本低，制備的電紡纖維膜持久耐用，易于分離回收。因此，靜電乳液電紡纖維膜可以認為是以包埋法固定化漆酶的理想載體。

2.2 漆酶活性評價

經紫外可見分光光度計測定漆酶催化氧化ATBS過程中的吸光度的變化，電紡納米纖維膜固定化漆酶對游離酶的活性保留率為78.5%。從這個結果可以看出，電紡纖維具有良好生物相容性的聚合物外殼，既保持了酶的活性，又保護了內部的漆酶分子不受外界環境變化的影響。纖維表面的多孔結構便于反應基團與漆酶分子的結合與分離，增加了漆酶的活性。電紡納米纖維膜這種特殊的結構提高了纖維內部漆酶活性的穩定性。

以PDLGA材料制備電紡纖維膜，且在相同條件下對100 μg/L和500 μg/L的BPA溶液進行反應，考察吸附性。結果表明，PDLGA制備的電紡纖維膜對水中BPA無明顯吸附。經5 h的反應之后，各組對兩種濃度的BPA溶液的吸附率均在20%以內，故本研究不考慮膜本身對BPA的吸附，只考察游離酶及固定化酶對BPA的降解作用。20 μL、5 mg/L的漆酶溶液與30 mL不同濃度的BPA水溶液反應2 h，降解率隨時間變化如圖4(a)所示。通過靜電紡絲制備電紡纖維膜，并載入漆酶。每一張約45 cm × 45 cm、厚0.5～1.0 mm的膜載有0.5 mL、15 mg/L的漆酶溶液。將膜剪成1.5 cm ×1.5 cm小方塊之后，每30 mL BPA溶液加入3片小方塊膜反應2 h，其降解率隨時間變化如圖4(b)所示。

圖4 游離漆酶及固定化漆酶降解水中不同濃度BPA的降解效率-時間曲線Fig.4 Degradation efficiency-time curves for the degradation of different concentrations of BPA in waterby free enzyme and immobilized enzyme

此游離酶和載酶膜對BPA的降解實驗旨在比較游離酶和固定化酶對水中BPA降解率的高低及隨時間的變化。從圖中可以看出，總體上來說，在2 h的反應時間內，對各濃度的BPA溶液，游離酶的降解率要高于固定化酶。游離酶對100 μg/L的BPA溶液在2 h內可以全部降解，而固定化酶對其的降解率可達83.5%。由于固定化的過程中對酶活不可避免地會產生一定的損失，且酶固定化后，與反應物的接觸面積比游離酶小，故固定化酶在相同時間內對BPA的降解率低于游離酶。從時間上來看，游離酶及固定化酶對各濃度BPA的降解率均隨時間遞增。相同酶量的游離酶和固定化酶對不同濃度的BPA溶液的降解率隨BPA的濃度增加而降低。對于高濃度(100 mg/L)的BPA溶液，游離酶及固定化酶的降解率分別為32.4%和31.7%。

2.3 溫度和pH對漆酶活性的影響

一般來說，生物酶產品受環境溫度和pH的影響較大，因此本研究重點考察溫度和pH對酶活的影響以及酶固定化前后活性和穩定性的變化。本研究比較了5個溫度梯度下相同酶量對5 mg/L BPA溶液的降解作用(如圖5所示)。從圖5可以看出，漆酶對高溫的耐受性較好，對低溫的耐受性較差。5 ℃條件下，2 h內游離酶對BPA的降解率為29.8%，固定化酶在此溫度下的降解率為31.2%，游離酶降解率不如固定化酶。在45 ℃條件下，游離酶的降解率可達89.4%，固定化酶為71.2%，游離酶隨溫度升高降解率波動比固定化酶劇烈。總體上來說，固定化酶對BPA的降解率隨溫度變化在31.2%～71.2%范圍內波動，而游離酶則在29.8%～89.4%范圍內波動，故漆酶固定化后受溫度影響比游離漆酶要小，即固定化酶對溫度變化的耐受能力強于游離酶。

H3PO4和NaOH溶液調節30 mL、5 mg/L BPA溶液的反應體系溶液pH為1、3、5、7、9后，加入20 μL、5 mg/mL的游離漆酶溶液或3片1.5 cm×1.5 cm的載酶膜小方塊反應2 h，BPA降解率隨時間變化如圖6所示。

圖5 不同溫度下游離漆酶和固定化漆酶對BPA降解率隨時間變化Fig.5 The degradation efficiency of BPA over time by free laccase and immobilized laccase at different temperatures

圖6 不同pH下游離漆酶和固定化漆酶對BPA降解率隨時間變化Fig.6 The degradation efficiency of BPA over time by free laccase and immobilized laccase at different pH values

與溫度類似，漆酶的活性受pH影響也較大。不同來源的漆酶，最適pH也不同。本實驗同樣對比了5個pH梯度下游離酶和固定化酶對5 mg/L BPA溶液的降解率和隨時間變化規律。從圖中可以看出，游離酶降解率最高的pH為7，此時對應的2 h降解率為59.8%，而固定化酶最佳pH為5，此時對應的降解率為64.7%。此外，固定化酶對pH變化的耐受性要遠遠強于游離酶。當pH為1時，游離酶的降解率為0，而固定化酶在pH=1時仍有12.2%的降解率。在pH=9時，游離酶與固定化酶的降解率均為37.2%?？傮w上來說，固定化酶對BPA的降解率隨pH變化在12.2%～64.7% 范圍內波動，而游離酶則在0～59.8%范圍內波動?？傮w上來說，固定化酶的穩定性優于游離酶，在特定條件下的催化活性也有一定優勢。

3 結 論

(1)漆酶以殼-核結構成功包埋于電紡納米纖維之中，該固定化漆酶對游離酶的活性保留率為78.5%。

(2)2 h內，固定化酶對100 μg/L的BPA溶液的降解率為83.5%，對100 mg/L的BPA降解率為31.7%。

(3)固定化酶對BPA的降解率隨溫度變化在31.2%～71.2%范圍內波動，游離酶隨溫度變化在29.8%～89.4%范圍內波動。

(4)固定化酶對BPA的降解率隨pH變化在12.2%～64.7%范圍內波動，游離酶隨pH變化在0～59.8%范圍內波動，故固定化酶的活性穩定性優于游離酶。