山楂主要成分提取分離及檢測分析研究進展

李春峰， 趙子璇， 劉桂艷

(北京理工大學生命學院分子醫學與生物治療重點實驗室，北京 100081)

薔薇科山楂屬植物在全世界現有一千多個物種，主要分布于北半球的溫帶地域，中國是山楂重要的發源地之一，現有山楂品種20個，變種7個，變型1個[1]。2020年版《中國藥典》收載的山楂和山楂葉，均為山楂屬的2個種山里紅CralaeguspinnatifidaBge.Var.majorN.E.Br.和山楂CralaeguspinnatifidaBeg.的植物來源[2]。山楂主要分布于在華北區的河北、山西、內蒙古，西北區的陜西、青海、新疆，東北三省以及華東和華中的部分省的半山地域[1]。作為山楂道地藥材產地的河北省興隆縣被林業部命名為“中國山楂之鄉”，山楂種植面積和產量居全國之首[3]。

山楂早在《本草經集注》中就有記載，其性微、溫，味酸、甘，歸胃、脾、肝經，具有消食健胃、化濁降脂、行氣散瘀、收斂止痢等功效[4]，臨床上主要用于治療食欲不振、高血脂和高血壓等疾病[5]。山楂葉在東晉《肘后方》中有記載，莖葉煮汁洗漆瘡，后兩代本草均有記載。黃酮類和三萜類化合物是山楂的活性成分，此外山楂中還含有苯丙素類、甾體類、有機酸類、有機胺類和其他營養物質等[5-6]。現代藥理研究表明，山楂果、葉和種子的提取物具有調節血脂、抗動脈粥樣硬化、抗心力衰竭、降血壓、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等作用[6]。本文對山楂中的黃酮類、三萜類成分的提取分離及檢測分析方法進行綜述，以期為山楂資源的進一步研究和開發利用提供參考。

1 黃酮類化合物

山楂中黃酮類化合物有6類，包括黃酮類(如牡荊素、葒草素等)、黃酮醇類(如槲皮素、金絲桃苷、蘆丁等)、二氫黃酮類(如柚皮素、北美圣草素及其苷等)、二氫黃酮醇類(如花旗松素及其苷等)、黃烷3-醇類(如兒茶素、白矢車菊等)、前花青素類(即黃烷聚合物類，如原花青素A2和原花青素B2等)[7]。山楂黃酮具有抗氧化應激、抗腫瘤、抗心肌缺血、抗慢性心力衰竭等作用[6]，在藥物研究和保健品開發方面極具潛力。提取分離山楂黃酮類成分為研究和開發其藥品和保健品提供有效的物質基礎。

1.1 提取方法

1.1.1 傳統提取方法 傳統的提取方法中既有不加熱的浸漬法、滲濾法，也有通過加熱提高提取率的煎煮法、回流法、連續回流法(也稱索氏提取法)等[8]。煎煮法相對于其他傳統提取方法雖然經濟、安全、簡便，但不適于提取不易溶于水或水煎煮易破壞的成分。單味藥山楂用煎煮法提取也有報道，張黎明等[9]用水煎煮法提取山楂葉總黃酮，折算提取總黃酮含量占藥材的2.19%。浸漬法和滲濾法用水或不同比例的有機溶劑(主要是乙醇)作溶劑，不加熱或低溫加熱，適于遇熱不穩定成分的提取，缺點耗時長、溶劑多、易變質。從提取效率上看滲濾法高于浸漬法[10-12]。回流法由于提取溶劑大多為有機溶劑，且溫度比煎煮法低，是研究最多也是目前制藥企業常用的方法。張明[12]對比浸漬法、回流法、滲漉法提取山楂總黃酮效果，結果顯示，使用70%乙醇提取時，總黃酮提取率回流法高于滲漉法和浸漬法；使用50%乙醇提取時，滲漉法總黃酮提取率高于回流法和浸漬法，且回流法液料比最小。連續回流提取法溶劑用量少，但是規模小，不適于工業化生產，是實驗室常用的提取方法之一。需要注意的是，連續回流長時間高溫加熱會破壞成分，不適于提取高溫不穩定的成分。

1.1.2 新型提取方法 近年來，提取方法中既有通過改變儀器設備而改變提取方式的，如超臨界流體萃取、超聲波輔助提取、微波輔助提取[8]、超高壓提取、快速溶劑提取、閃式提取等，也有通過添加化學成分增加提取率的提取方法，如添加表面活性劑、添加酶液等。超聲波輔助提取對于山楂果、葉和核的研究均有報道，但是優化后的工藝差別較大，提取率差別也很大，山楂果總黃酮提取率在6.21%～11.31%之間[13-14]。超聲聯合回流提取山楂核總黃酮，提取率(1.65%)是單獨回流提取的1.32倍[15]。超臨界流體萃取法具有選擇性，對于熱不穩定和弱極性成分具有很好的分離效果。如果用CO2作介質提取極性較大的成分需添加夾帶劑如乙醇、丙酮等。胡凱等[16]和劉慶文[17]分別采用極性亞臨界流體1,1,1,2-四氟乙烷(R134a)和超聲聯合CO2超臨界流體法萃取山楂果中的原花青素，提取率分別為2.50%、13.20%。微波法因具有加熱迅速、膜破壞完全、能量損失少等特點在山楂中也有研究報道。李敏等[18]和Luo等[19]分別對山楂果和山楂葉采用微波法和微波輔助酸水解法提取其中的黃酮類成分，提取率、得率分別為13.42%、2.62 mg/g。閃式提取法相對于其他提取方法最突出特點是提取時間短、速度快，但是存在規模小等缺點。楊燕新等[20]通過閃式提取法提取山楂核中的黃酮類成分，總黃酮提取率為0.64%。超高壓提取技術因其提取時間短、溶劑消耗少、低溫節能和效率高等特點受到人們的關注。孫協軍等[21]和周志強等[22]通過超高壓法分別對山楂果和山楂葉中黃酮類成分進行提取，山楂果中3個黃酮類化合物(槲皮素、蘆丁和金絲桃苷)的總提取率和山楂葉中總黃酮的提取率分別為0.055%、7.068%。駱曉沛等[23]優化超高壓提取、索氏提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取的工藝，結果顯示，山楂果中總黃酮提取率分別在最優工藝參數條件下依次為5.44%、5.12%、4.66%、3.76%。相對于其他3種方法，超高壓提取法保留了浸漬法的優點，具有溫度低、提取雜質少、提取率高、成本較低等特點。快速溶劑提取法雖然提取速率快、時間短，但是降解熱是需要關注的問題。曹會凱[24]通過對快速溶劑提取法、超臨界萃取法和微波法提取山楂果中黃酮類成分工藝的考察得出，3種方法的提取率依次為4.99%、3.80%、3.64%，結果顯示，快速溶劑提取法相比于其他2種方法具有提取率高、時間短和操作簡便等優點，適于工業化生產。生物酶法與傳統的提取技術相比，可以避免高溫條件下對活性物質的破壞，對提取物質起到保護作用。高文秀等[25]對不同酶解協同超聲波輔助提取山楂果中總黃酮的工藝進行研究發現，纖維素酶解協同超聲提取的總黃酮提取率(8.48%)比單獨超聲法和單獨用酶解法的提取率分別提高了29.5%、13.2%。表面活性劑提取法也是一種有效的提取方法。Han等[26]發現用添加表面活性劑的超聲提取法提取山楂中牡荊素等黃酮類化合物可以獲得較高的提取率。潘芳芳等[27]考察表面活性劑提取法和熱回流法提取山楂果中黃酮類成分的工藝，表面活性劑輔助法提取總黃酮的提取率(4.55%)相比傳統的乙醇回流法的提取率(3.78%)增加了16.97%，該方法一方面保留了熱回流提取法的優點，另一方面表面活性劑的使用增加了提取速率，在相同的提取條件下該方法可以提高提取率，節約時間和資源，但是對于不同提取物的表面活性劑的選取還需要有一定的經驗。

1.2 分離方法

1.2.1 常用分離方法 在山楂黃酮類化合物的常用分離純化方法中有因溶解度不同而實現分離的沉淀法和萃取法；也有因填料不同的大孔吸附樹脂、聚酰胺、硅膠、葡聚糖凝膠等常壓柱色譜法(也叫柱層析法)以及硅膠中壓和C18高壓制備液相色譜法等[8]。色譜法在山楂的分離純化中使用較多，可根據化合物的極性大小、是否含有羰基和羥基、分子大小和帶電荷的不同從而選擇不同的填充劑進行分離[8]。大孔吸附樹脂是氫鍵或范德華引力吸附和分子篩共同作用[8]，而且連續使用性能穩定，不需要經常再生，已廣泛用于制藥企業工業化生產中，是分離純化山楂總黃酮或原花青素類成分使用最多的色譜分離方法。趙立輝[28]使用柱層析法考察4種大孔吸附樹脂(AB-8、FL-1、FL-2、FL-3)和聚酰胺對山楂果中黃酮類化合物的純化性能，結果表明，AB-8、FL-3樹脂純化后樣品純度分別為86.6%、85.0%，加樣回收率分別為85.0%、80.0%，具有較好的純化效果。張黎明等[9]和宋小鋒等[29]都使用D101大孔吸附樹脂分離純化山楂葉提取液中的總黃酮，純度均在82%以上。劉麗南等[10]使用HPD826 氫鍵型樹脂純化，制備的提取物中10種原花青素成分總含量占干重的42%。祝波等[30]使用D101大孔吸附樹脂分離純化山楂果提取液中的原花青素，原花青素B2的純度從7.42%提高到34.39%。聚酰胺吸附量相對較大，分離效果好，但其洗脫速度較慢，且不能多次重復使用。張偉等[31]對復方山楂提取物中總黃酮的分離純化工藝進行研究，發現使用聚酰胺樹脂分離純化后的總黃酮純度可達到80.1%，純化物中總黃酮保留率高達93.0%。葡聚糖凝膠主要依靠分子篩作用，適用于初步分離后進一步純化黃酮類化合物的過程。馬娟娟[32]對葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱分離純化山楂葉粗黃酮粉末的方法進行研究，結果顯示，40%乙醇洗脫得到3個組分，組分1～2合并總黃酮純度以及組分3的總黃酮純度分別為83.27%、94.27%。上述常壓色譜分離法具有易操作，不需要昂貴設備等優點，常被用于化合物的組分分離，但是常壓色譜分離時間較長，分離單一化合物效果不理想。在分離純化單一化合物時，常采用中壓、高壓制備液相色譜或薄層制備色譜等幾種技術聯合使用。李晶等[33]聯合應用硅膠層析、葡聚糖凝膠(SephadexLH-20)常壓柱色譜和反相制備高壓液相色譜(RP-Pre-HPLC)從山楂果實中分離出1個新化合物。

1.2.2 新型分離方法 相比于傳統的分離方法，近年發展起來的新型分離純化方法如高速逆流色譜、膜分離[8]和分子印跡等方法因具有操作時間短、制備量大、純度高等特點而受到人們的關注。高速逆流色譜法和膜分離技術都具有分離效率高、操作簡單等特點，前者在分離時樣品負載能力強、制備量大、重現性好，而后者在分離時不損害物質活性、分離效率高、能耗低、無污染并且可連續生產。分子印跡法因具有預定性、專一識別性、高度的穩定性和較長的使用壽命而受到人們關注。劉妧晨等[34]采用索氏提取聯用分子印跡分離技術研究山楂中槲皮素的提取和分離同步進行的方法，結果顯示，槲皮素的提取率(0.033 mg/g)是常規索氏提取效率的15倍，但分子印跡萃取法因過程較復雜、外加成分多、成本高等原因還未能推廣使用。對于難分離的物質例如同分異構體需要幾種方法聯合使用以得到理想的分離效果，例如聯合應用高速逆流色譜法(HSCCC)與制備液相分離法分離山楂黃酮類成分，分離出的黃酮化合物(兒茶素、牡荊素等7個)的純度超過98%[35]。

1.3 檢測分析方法

1.3.1 常用檢測分析方法 化學成分的檢測分析主要包括定性和定量2個方面。薄層色譜(TLC)和高效液相色譜(HPLC)或高效氣相色譜(HPGC)是最常用的定性和定量檢測方法。對混合物中已知化合物進行定性時需要對照品比對，TLC和HPLC或HPGC因其具有靈敏度高、精確度高、操作簡便和適用范圍廣等特點被廣泛應用于化學成分的定性檢測分析中。對于分離純化得到的單一未知化合物確定結構常用的方法是1H和13C的一維或二維的核磁共振波譜(1H-NMR、13C-NMR)、不同質核比的質譜(MS)、伸縮或彎曲振動的紅外光譜(IR)和電子躍遷的紫外(UV)光譜等聯合應用確定化合物結構。李晶等[33]從山楂葉中提取分離純化得到1個化合物，采用HR-ESI-MS、IR和1H-NMR、13C-NMR的一維和二維譜等多種檢測方法，確定化合物的結構式，為新化合物，命名為2′-羥基-7-(3-羥丙基)-6-甲氧基-黃酮。TLC和HPLC或HPGC也是常用的定量檢測法，測定混合物中某些化合物的含量需要用某些化合物作為對照品，并以對照品的不同濃度作標準曲線，以測定混合物中化合物的含量。TLC法具有操作簡單，分析速度快，樣品用量少，可同時測定多個樣品等優點，但是定量的精確度不高。HPLC法因其靈敏度高、準確度高等優點，是測定山楂中黃酮類化合物最常用的定量方法。黃怡等[36]建立了HPLC同時測定山楂葉提取物中牡荊素-2″-O-鼠李糖苷、金絲桃苷、槲皮素、山柰酚的含量，結果表明，HPLC法具有較高的精確度和靈敏度。胡玉等[37]以非離子表面活性劑、膠束萃取-濁點預富集與超聲萃取技術結合HPLC法測定山楂果中的芹菜素等9種成分含量，該方法簡便快速，環境友好，準確度高。目前對于定量測定混合物中某類成分總的含量最常使用的是紫外-可見分光光度法(UV-VIS)，雖然該方法不能準確定量某類成分的真實含量，但是因其簡便快速，仍然是山楂中總黃酮含量測定最常用的方法。張文莉等[38]以蘆丁為對照，采用2種顯色系統NaNO2-AI(NO3)3-NaOH和A1C13，用紫外-可見分光光度法對山楂葉提取物中總黃酮含量進行測定和比較分析，2種顯色法測定的結果偏差較大，該方法的精確性和準確度在混合物含量測定方面還需改進和完善。

1.3.2 新型檢測分析方法 為了快速檢測混合物中的化學成分，超高效液相色譜(UPLC)因其檢測速度和分離度均優于傳統的HPLC而備受青睞。但若使用不當，色譜柱很容易堵塞。液-質連用的分析技術(HPLC-MS)，檢測前不需要對樣品進行特殊的前處理，具有靈敏度高、檢測速度快、操作簡便等優點，該方法定性和定量檢測能同時進行[24]。Zhang等[39]建立超高效液相色譜與電噴霧電離串聯質譜(UPLC-ESI-MS/MS)聯用的方法，通過該方法分離測定山楂葉中牡荊素-4″-O-葡萄糖苷等4種黃酮類化合物，與HPLC法相比，該方法不一定需要對照品比對也能檢測鑒別混合物中化合物的結構，但是儀器相對昂貴，通常需要專業人員進行操作和維修，成本較高。

2 三萜類化合物

山楂中的五環三萜化合物有3種類型，包括烏蘇烷型(熊果酸、科羅索酸等)、齊墩果烷型(如山楂酸、齊墩果酸等)、羽扇豆烷型(如白樺酯酸)；四環三萜類化合物主要有環阿屯烷型(如環阿屯)、羊毛脂烷型(如牛油樹醇、24-亞甲基-24-二氫羊毛脂甾醇等)[7]。目前，三萜酸(五環三萜)是山楂中三萜類成分研究的主要對象，如山楂酸、熊果酸、科羅索酸、白樺酯酸和齊墩果酸等，因其具有一定的抗病毒[6]和抗糖尿病[40]等重要藥理作用而受到研究者的關注。

2.1 提取方法

2.1.1 傳統提取法 熱回流法也是較多地應用于山楂中三萜類成分的提取。呂丹等[41]采用熱回流法提取山楂果皮中的三萜類化合物，提取率為1.98%(即提取總三萜占山楂果皮中的含量)，并且實現同步提取多酚和黃酮類成分，既節約成本，又避免資源浪費。陳寶龍等[42]通過比較95%乙醇回流法、堿醇水浸提法、60%乙醇回流法和堿水超聲法提取山楂果中三萜酸(齊墩果酸和熊果酸)，結果發現，齊墩果酸和熊果酸在前2種方法的剩余殘渣中均未被檢測到，表明提取較為完全，而在后2種提取方法殘渣中均被檢測到，表明未提取完全。結合實際生產情況，堿醇水浸提法提取效率高、成本低、安全、易于規模化，故選取堿醇水溶液浸提法為最終方案。

2.1.2 新型提取方法 在近年發展起來的提取方法中，超聲波輔助提取對于提取山楂果和果皮中的三萜類化合物均有報道，其中凍融-超聲提取法提取山楂果中三萜酸和超聲提取法提取山楂果皮渣中三萜酸的提取率分別為3.41%[43]、2.33%[44]。微波提取法較多研究于山楂核和果中的三萜類化合物提取，通過在最佳提取工藝條件下比較可以發現，山楂果中三萜酸的含量(提取率3.42%)高于核中三萜酸的含量(提取率1.14%)[45-46]。植奇明[47]選擇95%乙醇作為超臨界流體萃取山楂中總三萜的夾帶劑可以獲得較高的提取率。協同提取是在較短時間、溶劑消耗少的情況下可獲得較高提取率。寇云云[48]通過考察微波輔助提取、熱回流提取和超臨界流體萃取山楂總三萜的工藝研究，得到采用單一提取方法提取山楂總三萜的提取率依次為4.08%、2.57%、0.97%，但3種方法協同提取(超臨界-回流-微波)獲得的提取得率可高達5.13%，結果表明，相對于單一的提取方法，將各個方法的優點結合在一起進行協同提取是一種有效的提取方法，也為新型提取技術的發展提供了借鑒。相對于傳統的提取方法，近年發展起來的方法普遍具有提取效率高、時間短和得率高等優點，但是這些方法由于成本普遍較高，使用中儀器易出現故障，若進行工業化生產還需要針對以上問題進行不斷地改進和完善。

2.2 分離方法 重結晶法、大孔吸附樹脂層析法是分離純化山楂中三萜類成分常用的方法。黃超華等[49]使用重結晶法從山楂果中分離純化得到純度較高的熊果酸。袁懷波等[50]采用AB-8大孔吸附樹脂串聯柱分離山楂果中的三萜酸，用70%乙醇洗脫得到總三萜酸洗脫率和純度分別為79.02%、29.02%。柱層析法是分離山楂三萜類化合物常用的技術，然而單一的方法不能有效的分離純化，常需要結合其他方法連續分離以提高分離效率。陳寶龍等[42]通過比較3種純化山楂三萜酸中有效成分的方法，結果表明，齊墩果酸和熊果酸用大孔樹脂純化后的純度在50%以下，活性炭吸附純化后的2種三萜酸純度較高為59.04%，而活性炭吸附聯合結晶純化后的2種三萜酸純度大于70%，并且不會導致三萜酸的損失，是山楂中三萜酸純化分離的理想方法。目前分離純化山楂中單一化合物最有效的方法仍然是制備液相色譜，對于較難分離的化合物能夠起到很好的分離效果。Qiao等[51]將該方法與柱層析法聯合使用可以快速、有效地從山楂果中分離鑒定15種三萜酸類成分。

2.3 分析檢測方法

2.3.1 常用檢測分析方法 分光光度法和高效液相色譜法是檢測三萜類成分常用的方法，前者是基于三萜苷元和香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色的顏色反應，是一種快速、簡單的測定總三萜類成分的方法；后者在三萜類化合物檢測分析中廣泛應用，具有檢測精度高、分析速度快等優點。黎海衫[52]采用90%乙醇熱回流提取和AB-8大孔吸附樹脂分離山楂果中的熊果酸，HPLC法測定熊果酸含量，熊果酸浸出率1.07%，純度97.0%，回收率大于98.1%。林科等[53]將山楂果中熊果酸用乙醇浸提，濃縮后的沉淀用堿水溶解酸水沉淀得熊果酸粗品，再通過大孔吸附樹脂進行分離，純化后的熊果酸用分光光度法測定純度達到90%。李建中[54]采用可變波長高效液相色譜建立三萜類化合物含量測定方法，在該方法下檢測山楂中的三萜類化合物熊果酸和齊墩果酸不但能夠得到較好的分離效果，而且還具有精度高、快速準確和操作簡單的特點。采用紅外光譜、核磁共振波譜和質譜等也是山楂中三萜類化合物鑒定結構常用的方法。黃超華等[49]通過薄層色譜法和紅外光譜法對山楂提取物中的有效成分進行分析和鑒定，最終確定是三萜類物質熊果酸。宋少江等[55]對55%乙醇水洗脫部分進行分離純化后，采用IR和NMR法進行結構分析與鑒定，最終確定熊果酸等5個化合物。Zhou等[56]對70%乙醇回流提取部分分離純化后，采用NMR和HR-ESI-MS等方法鑒定得到1個新的倍半萜。

2.3.2 新型檢測分析方法 液質聯用等新型檢測分析技術的應用，對于山楂中三萜類化合物的研究具有重要意義。許紅蕾等[57]采用液相色譜-二極管陣列光譜檢測/電噴霧離子化質譜(HPLC-DAD/ESI-MS)聯用技術從山楂葉提取物中鑒定得到11個化合物。岳曉芝[58]采用HPLC/ESI-IT-MS法和喬曉莉等[59]采用超高液相/電噴霧-飛行時間/質譜(UPLC/ESI-TOF/MS)法分別從山楂中分析鑒定出了12、13個化合物。馬志良等[60]采用柱前衍生高效液相色譜-熒光檢測/質譜聯用法(HPLC/FLD-APCI/MS)同時測定6種三萜酸的含量。在山楂三萜類化合物的檢測與分析方法中，隨著檢測分析技術不斷發展，由測定單一成分的薄層色譜法以及紅外光譜法逐漸發展成為同時測定多種化合物的液相色譜和電噴霧離子化質譜(HPLC-DAD/ESI-MS)聯用技術，該檢測方法也將含量測定和結構鑒定結合到了一起，這些新技術的應用不但具有較高的精確度和準確性，而且操作簡便、檢測時間短，對于山楂有效成分的進一步研究和發展具有重要的推動意義。

3 展望

近年來，很多新的技術已被廣泛地用于山楂有效成分的提取分離和檢測分析中，獲得了大量的研究成果，有力地推動了山楂中有效成分的深入研究和發展。在提取技術方面，新的提取方法如超聲提取、微波提取和超臨界萃取等都具有縮短提取時間、提高提取率等優點，但是新的提取技術儀器成本較高，儀器容易出現故障等問題還需要進一步的改進。而相對傳統的提取方法熱回流提取，由于該方法具有成本低，環保無污染，簡便易行等一些優點依然是工業生產中常用的方法。在分離純化方面，萃取法、沉淀法和柱色譜法等單獨的分離技術還不能使化合物分離的純度較高。將不同的分離純化技術進行聯合使用，可以實現有針對性的連續分離，能夠極大地縮短分離時間，提高分離效率和純度。在檢測分析方面，對于總提物含量的測定大多使用分光光度法測定，通過標準品曲線進行含量計算，雖然該方法簡便易行，短時高效，但是由于雜質和溶液本身對檢測結果存在較大的干擾，該方法的準確性還有待進一步完善和提高。在對山楂有效成分的進一步研究和開發中，如何將傳統的技術方法和新型的技術方法相結合，取長補短，協同創新，實現易行高效、經濟節能和利于環保的技術應用于實際的科學研究和工業化生產中將是急需解決的主要問題。