線粒體Higd 1a在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的研究進(jìn)展*

葉超群 黃會芝

缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生兒期常見的嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病，無論是足月兒還是早產(chǎn)兒，都有較高的死亡率；此外，HIBD 也是兒童嚴(yán)重神經(jīng)殘疾的主要原因。每年，全世界1.3 億新生兒中有400 萬嬰兒患有HIBD，其中有100 萬人死于腦損傷，存活下來的HIBD 嬰兒通常會遺留智力低下、腦癱、癲癇和其他功能障礙，嚴(yán)重影響了患兒的生活質(zhì)量。這無論是對于患兒家庭還是社會而言，都是嚴(yán)重的創(chuàng)傷[1-2]。然而，HIBD 發(fā)病機制尚未完全明確，亞低溫是目前唯一公認(rèn)有效的治療方案，但對于中重度腦損傷患兒的療效有限，仍有相當(dāng)一部分患兒死亡或存在各種形式的后遺癥[3-5]，因此迫切需要新的治療策略。

缺氧誘導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)域蛋白-1a（hypoxia inducible gene domain family 1a，Higd 1a）又稱為HIG1 或HIMP1-a（hypoglycemia/hypoxia inducible mitochondrial protein 1）是一種存在于多種類型細(xì)胞線粒體的內(nèi)膜蛋白，在真核生物中廣泛表達(dá)，包括真菌和人類。Higd 1a 最初在人工培養(yǎng)的人宮頸上皮細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，遂被證明可以在富含神經(jīng)元的原代培養(yǎng)基中被低氧誘導(dǎo)及在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中被鎳誘導(dǎo)[6-7]。近年來發(fā)現(xiàn)其在腦、心臟、結(jié)腸、腎和肝臟等組織中普遍表達(dá)，而在小鼠的小腦、額葉和皮質(zhì)中表達(dá)水平尤為明顯。Higd 1a 由93 個氨基酸組成，分子量為10.6 kDa，等電點為9.8，基因定位于8 號染色體8q32，基因庫序列編碼AY062253，基因序列全長527 bp。Higd 1a 具有兩個跨膜區(qū)，它的兩個選擇性剪接產(chǎn)物（HIMP1-a 和HIMP1b）各自形成一個跨膜環(huán)，“U”形穿過線粒體內(nèi)膜，并具有“N 端-C 端”方向，其N 端和C 端位于線粒體內(nèi)膜外側(cè)。Higd 1a 受缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）調(diào)控，主要由缺氧和低糖誘導(dǎo)表達(dá)，參與應(yīng)激反應(yīng)中的抗凋亡過程，并與微環(huán)境應(yīng)激條件有關(guān)，其中也以缺氧最為多見。據(jù)報道，Higd 1a 具有調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)功能，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞內(nèi)功能，如能量的產(chǎn)生、維持氧化還原穩(wěn)態(tài)及鈣穩(wěn)態(tài)、抗細(xì)胞凋亡等[8-9]。Higd 1a 在低氧條件下的抗細(xì)胞凋亡作用為新生兒缺氧缺血性腦病的治療提供了新的方向，故本文主要綜述Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的分子機制及Higd 1a 在缺氧缺血中的作用，并為Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性腦損傷中的應(yīng)用提供更有力的證據(jù)，為進(jìn)一步探索腦缺氧缺血性損傷的治療提供新的靶向治療方案。

1 線粒體Higd 1a在缺氧缺血性腦損傷中的分子機制

缺氧缺血性腦損傷的具體機制尚不完全明確，興奮毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡機制共同參與并最終導(dǎo)致腦損傷，線粒體損傷則貫穿整個損傷過程，并成為新生兒缺氧應(yīng)激后的神經(jīng)退行性變中的關(guān)鍵階段，與隨后誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通路有關(guān)，是缺氧缺血損傷的關(guān)鍵標(biāo)志[10-11]。當(dāng)缺氧缺血時，腦細(xì)胞線粒體在缺氧早期即發(fā)生一系列不可逆性損傷，腦作為體內(nèi)代謝最活躍的器官之一，較容易受到血氧供應(yīng)不足的損害[12]。腦缺氧缺血發(fā)生后，腦內(nèi)葡萄糖、糖原、三磷酸腺苷（ATP）和磷酸肌酸的濃度立即下降，并在缺血后10～12 min 幾乎完全耗盡。根據(jù)動物模型的缺氧缺血狀態(tài)的研究已證實，在缺氧缺血開始后的幾分鐘內(nèi)即已出現(xiàn)不可逆的神經(jīng)元損傷[13]。線粒體的結(jié)構(gòu)、功能異常與腦缺氧缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，線粒體的損傷程度同時也提示了缺氧缺血性腦損傷的嚴(yán)重程度[14]。在缺氧缺血等應(yīng)激條件下，腦細(xì)胞對能量的需求尤為明顯，而線粒體作為細(xì)胞能量代謝的中心，在腦細(xì)胞缺氧缺血損傷的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的影響，故而線粒體成為神經(jīng)保護(hù)的主要目標(biāo)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，Higd 1a 可以保護(hù)細(xì)胞免受低血糖和低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞的存活時間，這提示Higd 1a 在線粒體應(yīng)激保護(hù)中發(fā)揮重要作用[16]，Higd 1a 的高表達(dá)則提示了腦損傷的良好預(yù)后。

線粒體是細(xì)胞生物氧化和能量轉(zhuǎn)換的主要場所，為機體提供95%以上的能量，對維持細(xì)胞正常生理功能起著重要作用。然而線粒體卻是對損傷極為敏感的細(xì)胞器，其腫脹可由多種損傷因子引起，其中最常見的即為缺氧。Higd 1a 的表達(dá)是由缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）誘導(dǎo)，Higd 1a 可能在線粒體呼吸鏈中發(fā)揮多效性作用。暴露在18%和5%氧氣中的細(xì)胞之間的Higd 1a 蛋白水平?jīng)]有顯著差異，但在缺氧早期，Higd 1a 蛋白水平升高?？梢娋€粒體Higd 1a 在腦缺氧缺血性損傷中的作用主要與氧化呼吸鏈有關(guān)，包括正向調(diào)節(jié)細(xì)胞色素C 氧化酶的產(chǎn)生及抑制氧氣消耗，降低細(xì)胞活性氧水平。近年來有研究發(fā)現(xiàn)中視神經(jīng)萎縮相關(guān)蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）、γ 分泌酶復(fù)合體與Higd 1a 在缺氧條件下的表達(dá)相關(guān)，可能成為Higd 1a 在腦缺氧缺血性損傷中不可缺少的部分。

1.1 Higd 1a 與細(xì)胞色素C 氧化酶 細(xì)胞色素C 氧化酶（cytochrome c oxidase，CcO）是線粒體電子傳遞系統(tǒng)的末端成分，同時也是呼吸電子傳遞鏈的第四個中心酶復(fù)合物，因此又被稱為復(fù)合物Ⅳ（complex Ⅳ），是細(xì)胞耗氧的主要部位，也是以ATP的化學(xué)形式產(chǎn)生有氧能量所必需的[17]。一方面，Higd 1a 參與復(fù)合體Ⅳ的組裝，以形成呼吸超復(fù)合體[18]。另一方面，細(xì)胞色素C 與Higd 1a 結(jié)合，使血紅蛋白的親和力下降，由于CcO 是體內(nèi)唯一一種可以利用氧氣進(jìn)行能量傳遞的酶，因此也有研究認(rèn)為CcO 的調(diào)節(jié)機制依賴于氧濃度[19]。Hayashi 等[20]在尋找一種由低氧驅(qū)動的CcO 調(diào)節(jié)因子的過程中發(fā)現(xiàn)Higd 1a 是CcO 的正調(diào)控因子，通過純化外源性Higd 1a 蛋白，建立ATP 敏感的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）探針檢測內(nèi)源性Higd 1a 蛋白的表達(dá)量，證明了通過內(nèi)源性誘導(dǎo)Higd 1a 的表達(dá)及外源性增加Higd 1a 蛋白都可提高CcO 的表達(dá)量。該研究發(fā)現(xiàn)在Higd 1a 缺氧早期被瞬時誘導(dǎo)，直接連接并整合到CcO 大分子復(fù)合體中，并使CcO 的活性中心—血紅素a 的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)氧化磷酸化過程，使ATP 的產(chǎn)生增加，從而保護(hù)細(xì)胞免受缺氧的影響。Higd 1a 是CcO的一個先前未知的調(diào)節(jié)成分，并且代表著與CcO 活性降低相關(guān)的疾病的治療靶點，為細(xì)胞的缺氧缺血性損傷提供新的治療方向。

1.2 Higd 1a 與活性氧（ROS）線粒體的關(guān)鍵功能是產(chǎn)生ATP，并作為細(xì)胞中的能量發(fā)生器，它們在需要高濃度ATP 的大腦和心臟組織中尤其重要。然而，高水平的ROS 是高ATP 產(chǎn)生的副產(chǎn)品。Li 等[21]研究發(fā)現(xiàn)在線粒體損傷時，高水平的ROS 可以通過上調(diào)PGC-1a 和HIF-1a 的表達(dá)來誘導(dǎo)Higd 1a 的表達(dá)，并通過幫助維持正常的線粒體功能來保護(hù)細(xì)胞免受缺氧的影響。另一方面，Higd 1a 基因敲除實驗表明，即使在常氧條件下，Higd 1a 缺失也會增加活性氧的產(chǎn)生，并損害線粒體的跨膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Guo 等[22]證明了在豬的支持細(xì)胞中，過表達(dá)的Higd 1a 可抑制ROS 的水平。此外，在缺氧和缺血期間，ROS 的大量產(chǎn)生與腦損傷之間有直接關(guān)系，而且與其他器官相比，Higd 1a 在大腦和心臟中的表達(dá)水平非常高。這表明Higd 1a 可能會抑制這些腦組織中過量的ROS 產(chǎn)生，并保護(hù)它們免受氧化應(yīng)激的傷害。

1.3 Higd 1a 與OPA1 OPA1 基因?qū)儆诤嘶颍幋a的蛋白是線粒體內(nèi)源發(fā)動蛋白，是線粒體塑形蛋白家族的成員。OPA1 蛋白有L 和S 兩種亞型，參與線粒體內(nèi)膜融合，對線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)有著重要的作用。OPA1 與呼吸作用復(fù)合物直接相關(guān)，作為呼吸鏈的一部分，保持呼吸鏈的完整性，參與呼吸作用和能量代謝，在細(xì)胞凋亡過程中則與早老素相關(guān)菱形樣（presenilin associated rhomboid like，PARL）蛋白以O(shè)PA1-PARL 復(fù)合體的形式發(fā)揮抗凋亡因子的作用。

An 等[23]實驗證明，Higd 1a 的N 端與OPA1 結(jié)合，進(jìn)而保護(hù)OPA1 L 亞型免受誘導(dǎo)切割；Higd 1a沉默則導(dǎo)致L 亞型丟失，繼而線粒體脊裂解，線粒體DNA 丟失，細(xì)胞生長遲緩；然而，在細(xì)胞處于低氧條件（0.1%O2）下12 h，Higd 1a 過表達(dá)并延長OPA1 L 亞型的切割時長至6 h。由此可知，在正常條件下，Higd 1a 通過結(jié)構(gòu)性表達(dá)保持OPA1 的完整性，而在缺氧條件下，它的過表達(dá)雖不能完全阻止OPA1 的切割，但通過推遲OPA1 的切割來緩解細(xì)胞壓力，維持線粒體完整性，進(jìn)而幫助細(xì)胞抵抗缺氧損傷，這一研究發(fā)現(xiàn)為對抗缺氧性損傷提供了新的治療方向。

1.4 Higd 1a 與γ 分泌酶復(fù)合體 γ 分泌酶復(fù)合體是由四個亞單位組成的膜內(nèi)蛋白水解酶，包括早老素（presenilin，PS）包括PS1 和PS2，中前咽缺陷蛋白-1（Aph-1），早老蛋白增強子-2（Pen-2）和Nicastrin，主要參與β-淀粉樣蛋白前體（APP）和Notch 蛋白等重要跨膜蛋白的切割和水解過程。Hayashi 等[24]從對γ 分泌酶抑制基因的篩選中分離到Higd 1a，并發(fā)現(xiàn)Higd 1a 的過表達(dá)可抑制γ 分泌酶活性。Higd 1a 與線粒體膜上的γ 分泌酶成分（PS1、Nicastrin、Aph-1 和Pen-2）直接結(jié)合，降低γ-分泌酶活性，從而減少ROS 的產(chǎn)生和線粒體功能障礙，此外，Higd 1a 的缺失增加了γ 分泌酶的激活，增強了缺氧所致的線粒體功能障礙。綜上所述，Higd 1a 過表達(dá)可使缺氧誘導(dǎo)的線粒體膜γ 分泌酶活性減低并減少細(xì)胞內(nèi)β 淀粉樣蛋白的積聚，從而減輕缺氧引起的線粒體功能障礙，故Higd 1a是線粒體γ 分泌酶復(fù)合體的一種新的調(diào)節(jié)劑，并在維持正常線粒體功能方面發(fā)揮重要作用，是涉及線粒體損傷性疾病的潛在治療靶點。

1.5 Higd 1a 與caspase caspase 是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶，與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與細(xì)胞的生長、分化與凋亡調(diào)節(jié)。為了解缺氧和Higd 1a 過表達(dá)是否影響caspases 的激活，An 等[25]將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Higd 1a 的巨噬細(xì)胞（RAW）在缺氧條件下培養(yǎng)6 d，并在指定的時間進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Higd 1a 的巨噬細(xì)胞（RAW）在低氧條件下比模型轉(zhuǎn)染細(xì)胞存活得更好，而將穩(wěn)定表達(dá)caspase的巨噬細(xì)胞在caspase 抑制劑下培養(yǎng)6 d 也明顯減少了細(xì)胞凋亡。這證明了caspase 活性是由Higd 1a 通過底物和caspase 抑制劑來調(diào)節(jié)的。降低caspases的活性參與了Higd 1a 細(xì)胞在缺氧條件下的存活效應(yīng)。

2 Higd 1a在缺氧缺血性疾病中的研究前景

Higd 1a 被發(fā)現(xiàn)在心臟、腦和肝臟組織中高度表達(dá)，在腎臟和骨骼肌中低水平表達(dá)[24]。Kurosh 等[26]實驗證明，內(nèi)源性Higd 1a 是體內(nèi)代謝應(yīng)激的潛在標(biāo)記物，常見于不同的病理狀態(tài)，如心肌梗死、缺氧缺血性腦損傷和不同類型的癌癥?？梢奌igd 1a在緩解缺氧缺血性組織損傷中有充分的理論證據(jù)。

外源Higd 1a 可以使低氧條件下斑馬魚線粒體中的呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ（C-Ⅳ）的活性增加，CcO 活性增加，同時增加ATP 的合成，提高心臟對于缺氧的耐受性，并發(fā)揮器官保護(hù)作用。在斑馬魚的缺氧模型中，通過測量線粒體ATP 濃度，可以證明Higd 1a 的組織保護(hù)作用。心臟特異性Higd 1a的過度表達(dá)緩解了低氧條件下線粒體ATP 的下降，并保護(hù)了斑馬魚的心功能[19]。這一結(jié)果表明，通過Higd 1a 模擬物可以增加CcO 活性，可能有治療線粒體疾病的潛力，為缺血性、代謝性和線粒體疾病的治療提供選擇。

Higd 1a 可對抗葡萄糖饑餓并通過減少細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤生長。Ameri 等[27]研究了Higd 1a 在多種人類癌細(xì)胞系中的調(diào)控模式，并發(fā)現(xiàn)在缺氧缺血最明顯的腫瘤壞死區(qū)域，代謝應(yīng)激源觸發(fā)Higd 1a 的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長。另一方面，Higd 1a抑制與乳腺癌治療后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，Higd 1a 抑制與乳腺癌治療后腫瘤復(fù)發(fā)相關(guān)，Higd 1a 會根據(jù)細(xì)胞在不同的應(yīng)激條件下進(jìn)而產(chǎn)生不同的效應(yīng)，當(dāng)嚴(yán)重缺氧的腫瘤細(xì)胞面臨葡萄糖剝奪時，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的活性被抑制，促進(jìn)Higd 1a 表達(dá)，對異常代謝環(huán)境適應(yīng)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞休眠[28]。這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞在極端環(huán)境的適應(yīng)機制提供了新的見解，Higd 1a可能在腫瘤休眠或復(fù)發(fā)機制中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)缺氧腫瘤區(qū)域Higd 1a 活性可能有助于克服在抗血管生成或HIF 抑制所介導(dǎo)的腫瘤休眠。線粒體蛋白HIGD 家族的小分子調(diào)節(jié)劑為這一可能性提供了方向[29]。

Higd 1a 在新生兒缺氧缺血性損傷時定位于細(xì)胞核。免疫熒光顯微鏡顯示，在對照的新生兒腦中，內(nèi)源性Higd 1a 主要在細(xì)胞核外少量表達(dá)；然而在缺氧缺血性腦損傷的新生兒腦內(nèi)，內(nèi)源性Higd 1a 的表達(dá)水平明顯升高[24]。Higd 1a 作為一種在應(yīng)激反應(yīng)中抗細(xì)胞凋亡的蛋白，在大鼠出生后的早期即廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其表達(dá)量在大腦中的分布不同并隨個體年齡的變化而變化。Higd 1a 在海馬、丘腦核、梨狀內(nèi)核和尾殼核高度表達(dá)，并隨著出生后年齡的增長，其表達(dá)量也逐漸增加。在嚴(yán)重應(yīng)激期間，即在缺血性心臟病、缺氧缺血性腦病和癌癥的背景下，Higd 1a 從胞漿池移位到細(xì)胞核，且Higd 1a的核定位與應(yīng)激的嚴(yán)重程度相關(guān)[30]。

綜上所述，Higd 1a 對于HIBI 后的線粒體損傷程度起到了明確的緩沖作用，Higd 1a 沉默會影響細(xì)胞融合。這些證據(jù)都提示了Higd 1a 的表達(dá)在HIBI中的研究價值，然而目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于Higd 1a靶向治療HIBI 的報道，外源性Higd 1a 靶向治療HIBI 的療效值得進(jìn)一步探究。