污水新型冠狀病毒監測研究進展及啟示

侯 敏，謝玉為，毛怡心，張 曉，張 良，王園媛，鄭和輝，顧 雯，雒月云，周海健，姚孝元，張 嵐，唐 宋,4*

1.中國疾病預防控制中心環境與人群健康重點實驗室，中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所，北京 100021

2.薩斯喀徹溫大學毒理學中心，薩斯喀徹溫薩斯卡通SK S7N5B3

3.中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206

4.南京醫科大學公共衛生學院全球健康中心，江蘇南京 211166

新冠肺炎(COVID-19)是近百年來人類遭遇的影響最大、波及范圍最廣的全球性重大傳染病.截至2022年6月27日，全球累計確診人數突破5.3億例，死亡人數超過6.32萬人[1].當前，全球新冠肺炎疫情仍高位流行，新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)不斷突變，“奧密克戎”變異株傳播力明顯增強、逃逸能力增加，已取代其他變異株，成為全球絕對優勢流行毒株[2].自2022年3月初以來，由境外輸入及繼發本土傳播導致我國出現了新一波新冠肺炎疫情，呈現多點、多源、多鏈、面廣、頻發等局面，規模化與散在聚集性疫情并存，已波及我國30個省份，造成重大社會影響.雖然我國堅持“科學精準、動態清零”的防控政策且取得成效，但“外防輸入、內防反彈”的疫情防控形勢依然嚴峻復雜，未來依然存在病毒變異、疫情暴發與擴散的巨大風險.

當前，針對新冠肺炎感染者的監測主要依賴“點對點”的“核酸檢測+抗原篩查”模式，雖然具有很高的敏感性和特異性，但是預防性大規模人群主動篩查費時、費力、經濟成本高、存在漏檢可能.因此，建立和開發實時、高效、靈活、經濟的新冠肺炎疫情暴發預警機制和監測技術尤為重要.基于污水流行病學方法(wastewater-based epidemiology,WBE)開展污水中新型冠狀病毒的監測，因其覆蓋人群廣泛，可為新型冠狀病毒及其變異株的出現、暴發和傳播提供早期預警信息，監測人群感染趨勢，識別變化拐點，有助于判斷新冠肺炎疫情發生、發展動態，提供實時數據與科學依據，輔助政府及相關部門更快、更有效地做出公共衛生決策[3-4].一些國家已在全國范圍內系統開展了污水新型冠狀病毒監測項目[5]，中國香港地區已實現全港范圍的新型冠狀病毒常規污水監測[6].隨著歐美發達國家臨床檢測規模日益縮減，WBE正逐步被納入人群健康監測網絡.鑒于此，該文歸納總結了當前全球有關污水新型冠狀病毒檢測、監測及預警研究的最新進展，分析其實際應用價值與指導意義，為我國下一階段新冠肺炎疫情或未來其他突發重大疫情的預測預警及精準防控提供借鑒與參考.

1 國內外污水中新型冠狀病毒的研究進展

1.1 新型冠狀病毒賦存特征、環境行為與歸宿

新型冠狀病毒屬于β屬冠狀病毒，為包膜病毒，與非包膜病毒相比生命周期較短[7].國內外研究發現，新型冠狀病毒感染者的尿液、糞便等人體分泌物中可檢出大量新型冠狀病毒[8-9].新型冠狀病毒可侵入腸道系統，破壞其平衡，導致腹瀉等癥狀，腹瀉發生率高達49.5%[10]，其在感染者糞便中的持續存活時間為22 d，長于呼吸道的18 d與血清的16 d[11].感染7個月后，糞便中仍可檢出新型冠狀病毒核酸(簡稱“病毒核酸”)[12].

新型冠狀病毒可通過感染者排遺、排泄、洗漱、游泳、洗衣等方式進入市政管網，再到污水處理廠，經污水處理后最終回到水環境中.該環境行為中存在潛在傳輸與暴露路徑[13].污水中新型冠狀病毒至少存在3種不同形式：傳染性病毒顆粒、非傳染性具有完整的病毒基因組、游離的病毒核酸[14].傳染性病毒顆粒的活性比病毒核酸的活性衰減速率快，如20℃污水中病毒核酸活性下降90%需3.3 d，而同樣溫度污水中傳染性病毒顆粒下降90%只需1.6 d[15].

新型冠狀病毒在污水中的活性受生物和非生物因素的影響，包括但不限于溫度、酸堿度、光照、微生物組成和活性、轉移和轉化機制、消殺措施等[16].研究表明，新型冠狀病毒在水中的存活時間隨溫度升高而降低，在4℃和26℃的污水中活性下降90%分別需要17.17和8.42 d[17]；可在pH=3~10的范圍內存活至少1 h，極端酸堿性會影響病毒穩定性[18].新型冠狀病毒在污水中的穩定性相對較差，容易被滅活，常見的污水處理方法，如使用含氯消毒劑、二氧化氯、過氧化氫、臭氧、紫外線消毒均能有效滅活新型冠狀病毒，并在一定程度上影響病毒核酸檢出[19].例如，Tomasino等[20]發現，未經處理的污水中可檢測到病毒核酸，而經3次處理、紫外線消毒后的污水中并未檢測到.目前，尚無從污水中分離培養出新型冠狀病毒活病毒或病毒通過污水傳播引起感染暴發的報道.

1.2 污水中新型冠狀病毒核酸的檢出情況及方法

隨著全球新冠肺炎疫情持續擴散，國內外關于市政污水與污泥[21]、海水[22]、河水[22]和地下水[23]中檢出病毒核酸的報道越來越多.病毒核酸在荷蘭、澳大利亞、印度、意大利、西班牙、美國、加拿大、英國、中國等國家的醫院、機場、社區、學校宿舍、污水處理廠、飛機、郵輪等的生活污水中均有檢出[24].部分國家污水中病毒核酸的檢出情況如表1所示.意大利污水樣本中最早檢出案例可追溯至2019年10月，該區域的污水樣本陽性率為11.6%~100%[51]，檢出濃度最高達4.6×105copies/mL[52].截至目前，已有至少11種新型冠狀病毒關注變異株(variant of interest,VOI)在全球肆虐，其中“奧密克戎”是許多國家的主要變異株，已在暴發區域內污水中大量檢出[53].

表1 全球污水中新型冠狀病毒的檢出情況Table 1 Detection of SARS-CoV-2 in wastewater worldwide

污水中新型冠狀病毒經稀釋后濃度較低，需富集濃縮以提高檢測的靈敏度.常用的富集方法包括超濾、超速離心、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀、膜吸附等，但不同方法的回收率差異較大.其中，超濾法的回收率為33%~42.6%[54]，PEG沉淀法回收率為0.62%~56.7%[55]，超速離心法回收率為12%[56].核酸定量多基于逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)以及逆轉錄微滴數字聚合酶鏈反應(reverse transcriptiondroplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法，常見擴增基因有開放讀碼框1a/b(open reading frame 1ab，ORF1ab)、包膜蛋白(envelope protein,E)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein,N)[57].關切變異株(variant of concern,VOC)或關注變異株(variant of Interest, VOI)的監測和確認多基于下一代測序技術(next generation sequencing, NGS)，但并不適用于病毒滴度較低的環境樣本.等位基因特異性PCR(AS-PCR)可彌補這一缺點，其操作簡便，靈敏度更高[58]，可用于特定VOC或VOI的實時篩查[59].研發自動化和高通量的污水樣本采集、富集濃縮、核酸提取及檢測的方法，可大幅提高污水中新型冠狀病毒的分析效率.

因病毒富集方法回收率樣本間差異大，有研究通過添加外源性內參，如牛冠狀病毒疫苗、滅活鼠肝炎病毒、噬菌體MS2、裝甲病毒顆粒，或利用內源性標志物，如辣椒輕斑駁病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)、人糞便特異性擬桿菌屬、交叉裝配噬菌體(crAssphage)，估計病毒富集回收率以校正回收率.此外，綜合考慮人群的遷移變化，人工甜味劑(acesulfame K)、糞固醇(coprostanol)、血清素代謝物(5-HIAA)等食物源或人源的人群數量標志物可用于校正因周末、節假日期間人群遷移導致的病毒滴度的差異.例如，D'aoust等[60]發現，經PMMoV校正后，可改善污水中N基因豐度的變化趨勢與臨床病例數據之間的相關性；Reynolds等[61]發現，與PMMoV和crAssphage相比，coprostanol作為內參時，污水中病毒核酸濃度與實際病例之間的相關性最強.但由于人群數量標志物受其環境行為、人群的健康狀況和生活習慣等影響，需綜合污水質量化學數據和多標志物指標對污水病毒核酸滴度進行數據分析，從而減少分析結果的不確定性，提升核酸濃度與新冠肺炎發病率相關性分析的可靠性[37].

2 污水新型冠狀病毒監測研究與進展

2.1 全球污水新型冠狀病毒監測項目與進展

基于全球污水中病毒核酸檢出的報道及相關研究進展，自2020年2月起，澳大利亞、歐盟26國(包括奧地利、比利時、德國、意大利等)、美國、加拿大、荷蘭、土耳其、中國香港等多個國家或地區已開展或計劃開展針對新型冠狀病毒的全國或局部水環境監測.在過去的兩年多內，全球開展污水新型冠狀病毒監測項目的國家已達67個，參與的高校與科研院所已達279個，監測點位3 393個[62]，主要集中在新冠肺炎疫情較為嚴重的歐美澳等發達國家與中國香港地區.例如，自2020年9月美國國家污水監測系統(national wastewater surveillance system, NWSS)啟動后，已有37個州、4個城市和2個地區的公共衛生部門在400多個點位開展污水監測活動，已采集34 000多份污水樣本[63].中國香港已設置112個常規采樣點，覆蓋530萬人口[6].監測項目從污水處理廠及居民社區收集污水樣本，對其進行檢測與分析，實時將監測結果反饋給公共衛生決策部門并向公眾公開，為覆蓋地區提供新冠肺炎疫情信息，使當地政府能夠更快、更有效地采取應對措施.部分代表性國家的污水新型冠狀病毒監測項目見表2.

表2 全球已開展的代表性污水監測項目Table2 Representative global wastewater surveillance projects

2.2 開展污水新型冠狀病毒監測的價值與意義

2001年，污水流行病學由美國環境保護局的科學家Christian G.Daughton博士率先提出[71]，通過檢測污水中目標化學或生物標志物的濃度，結合人體代謝、進水流量、輸送效率、服務人群等信息，反推獲得覆蓋區域內人群活動或健康狀況的定性和定量數據的一種監測方法.由于具有覆蓋范圍廣、可擴展、成本效益高等優勢，已被一些國家應用于追蹤藥物(如可卡因、甲基苯丙胺、抗生素)濫用情況、監測傳染性病原體(如諾如病毒、脊髓灰質炎病毒、多重耐藥性細菌等)，以及評價相關疾病流行程度與疫苗接種情況等方面，為進一步指導疾病防控和健康決策制定提供科學有效的手段.開展污水新型冠狀病毒監測工作具有以下實際價值：

a)WBE監測范圍大、成本低，可作為人群監測的重要補充.污水覆蓋區域廣、人口基數大，可涵蓋未能及時進行核酸、抗原或抗體篩查的人群或無癥狀感染者.因此，進廠水或街道社區污水的病毒核酸檢測可作為人群新冠肺炎動態監測(如哨點監測、發病率監測、臨床監測)的輔助補充[72].新冠肺炎疫情暴發后，有些國家和地區，尤其是中低收入國家的核酸檢測試劑盒和檢測設備供應緊張，檢測能力和人員不足，大規模人群主動篩查實施較為困難，而污水監測作為一種“點對面”、快速、“非侵入性”的方法，不會占用過多資源，節約人力、時間和經濟成本.即使在患病率較低的情況下，污水監測仍具有較高的靈敏度，為1~10人/(105人)[52].同時，污水監測不涉及個人隱私，社會倫理學代價低.

b)為新型冠狀病毒的出現和新冠肺炎疫情的暴發提供預警信息.多個國家對污水中病毒核酸開展時空監測，發現病毒核酸檢出早于發現當地確診病例2~63 d[73]，提示污水監測作為新冠肺炎疫情暴發預警的可行性和時效性.例如，美國多所大學(包括亞利桑那大學等)對學生宿舍污水進行檢測，發現并隔離多名無癥狀感染者[74]；中國香港根據社區污水新型冠狀病毒陽性檢測結果，發現“德爾塔”變異株并采取措施，避免了一次由其引發的新冠肺炎疫情[6].因此，開展污水新型冠狀病毒監測，能早期識別病毒的出現，預判新冠肺炎疫情暴發流行的時間起點，判斷特定區域的病毒傳播程度，提前采取干預措施(如主動核酸篩查和居家隔離)，提升精準防控水平，從而遏制病毒傳播，降低新冠肺炎疫情的不利影響.

c)突變檢測能用于新型冠狀病毒變異株的篩查、定量與溯源.對新型冠狀病毒單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)突變的擴增測序和系統發育分析可快速識別污水中的變異株[75]，了解病毒基因組的變異信息[76].例如，香港大學張彤教授團隊從污水中檢出變異株，早于臨床發現確診病例3 d[77]；抵達澳大利亞的國際航班污水中檢出“奧密克戎”變異株，與實際病例的基因組測序結果一致[78]，有助于快速篩查新型冠狀病毒感染情況.因此，應用AS-PCR或高通量測序技術開展污水中病毒核酸的突變檢測與分析，能夠篩查并定量VOC和VOI，發現新的病毒變異株，判斷病毒進化起源，有利于開展病毒溯源與新冠肺炎疫情研判分析，指導疫情精準防控.

d)預估與追蹤感染人數和新冠肺炎疫情規模，評估干預措施有效性.結合人體代謝、進水流量和服務人群數量等人口學及基礎信息資料，建立預測預警模型，反推病毒在監測覆蓋區域內的傳播狀況、估算感染人數[79]，有助于及時掌握新冠肺炎疫情發生、發展動態，提供防控建議.例如，西班牙開發了一種回歸模型估計包括無癥狀感染者在內的感染人數，其估算的感染人數(1 661人)與實際病例數接近(1 667人)[80]；荷蘭水循環研究所聯合英國、希臘和西班牙研究人員研發污水新型冠狀病毒監測模型“Sewers4COVID”，結合污水流行病學和機器學習，可快速、經濟、高效地監測全國范圍內的新冠肺炎疫情暴發熱點，預測大流行的暴發[67].污水病毒載量與人群疫苗接種率相結合，可確認疫苗的有效性[81]，污水中病毒核酸檢出濃度的下降，可為解除社交限制和隔離等防控措施提供支持.例如，美國印第安納州一項研究發現輝瑞疫苗接種后，污水病毒核酸濃度顯著下降，且連續12 d污水固體中未檢出病毒核酸[82].

3 污水新型冠狀病毒預測預警現存關鍵科學問題

3.1 污水中新型冠狀病毒的分布特征及感染性缺乏足夠研究

當前對污水新型冠狀病毒的監測、流行病預測預警模型的開發與應用，在很大程度上受污水中病毒的完整性、基因組或核酸片段的持久性、病毒傳染性等方面的限制[83].感染者糞便中病毒載量、每天排便量、污水流量、下水道傳輸效率等不確定因素均會造成污水樣品采集和檢測準確性的偏移，難以反映真實的病毒載量、人群感染比例與新冠肺炎疫情的變化趨勢.與此同時，由于污水基質較為復雜，難以分離培養其中的活病毒，關于污水中新型冠狀病毒活性、傳染力的機制仍不清楚，新型冠狀病毒是否可通過水環境傳播導致暴發尚缺乏足夠的科學證據.

3.2 污水中新型冠狀病毒的富集濃縮及檢測方法亟待標準化

由于污水中新型冠狀病毒濃度較低以及方法本身的局限性，如何準確、靈敏、高通量、低成本地采集、富集濃縮與檢測污水中的病毒核酸依然面臨巨大挑戰.現階段核酸富集濃縮與檢測方法存在以下差異：一是既往大多數監測針對污水的液相部分進行病毒核酸提取和檢測，忽略了固相懸浮物吸附的病毒顆粒；二是濃縮方法、核酸提取和檢測方法的靈敏度、特異性、安全性亟待進一步解決.由于病毒核酸極不穩定，在污水中會被高度稀釋和降解，獲得較為完整的基因組序列相當困難[84].針對新型冠狀病毒WBE現有的文獻多集中于優化樣品收集和處理上，而缺少污水采樣方案設計的研究.目前，全球缺乏統一的標準方法來監測污水中的新型冠狀病毒，包括從污水采集、保存、運輸、預處理、富集濃縮、核酸提取、檢測分析到最終的數據解讀，以及全過程的質量控制，這些環節均對最終結果的科學性和有效性至關重要.

3.3 污水新型冠狀病毒的預測預警模型開發與應用的局限性

由于污水監測采用的是“點對面”的預測模式，從污水管網末端采樣，要實現病例的精準追蹤和感染規模的精確評估預測預警能力較為困難，特別體現在：①污水管網覆蓋監測人群區域的比例對于結果準確性(漏檢)的影響.②清潔劑、消毒劑等日化用品的使用和消殺措施等對病毒顆粒或核酸穩定性造成的影響.③檢測方法靈敏度的限制，因為低于檢出限的陰性結果并不等于零病例.④對于預測預警模型建立的制約，體現在不同變異株病毒載量和脫落率的差異性等.⑤新型冠狀病毒的排遺特征數據不足，缺乏各年齡組、性別組、感染的病毒變異株組和感染/疾病進展中的病毒攜帶載量和排出量數據.解決上述問題：首先，需要了解感染者糞便中病毒核酸載量，確保污水樣本對目標人口的代表性，明確病毒在污水中的稀釋情況及檢出限；其次，需要完善的污水收集處理管網，根據實際需求進行靈活的采樣設計，如從上游至下游的全覆蓋監測策略或針對熱點區的重點監測策略；最后，需要與流行病學家、環境工程師和公共衛生人員等密切合作.

4 全球污水新型冠狀病毒預測預警研究對我國的啟示

我國幅員遼闊，人口眾多，污水監測可作為目前新冠肺炎監測體系的重要補充，實時掌握全國重點地區和重點場所的污水中新型冠狀病毒分布特征和新冠肺炎疫情發生發展動態，特別是有助于無癥狀感染者的早期發現.對污水病毒核酸陽性區域進行風險級別研判，開展核酸序列突變監測，通過污水管網回溯提示污水處理廠覆蓋社區和居民病毒變異株的感染情況，在空間上縮小調查與篩查范圍，節約人力、時間與經濟成本，提升精準防控水平.我國可循序漸進開展以下工作：

a)建立標準，形成污水新型冠狀病毒及變異株的檢測技術規范.2022年3月24日，國家衛生健康委員會發布了WS/T 799?2022《污水中新型冠狀病毒富集濃縮和核酸檢測方法標準》，明確相關具體操作規程，為我國污水新型冠狀病毒監測提供了重要依據和技術指導.但是，針對全球范圍出現的高度傳播的新型冠狀病毒變異株，仍需建立新的檢測技術方法，快速鑒定并追蹤不同的病毒變異株以及新出現的變異株，便于及時采取應對措施.

b)合理應用，為未來新冠肺炎疫情的再次暴發做好技術與應用儲備.目前我國一些地區已初步開展了污水流行病學的研究應用.例如，廣東省疾病預防控制中心開展污水中諾如病毒監測，提前1~2個月發現諾如病毒變異株[85]；中國疾病預防控制中心病毒病所在新疆的污水樣本中發現星狀病毒等[86]；中國疾病預防控制中心環境所聯合當地疾控對云南省某市新冠肺炎患者救治醫院、隔離點等高風險場所的污水、河流水體等進行檢測，發現醫院污水中新型冠狀病毒檢出率為100%；中國疾病預防控制中心傳染病所聯合新疆當地疾控在南疆傷寒流行熱點地區開展醫院污水檢測，分離到傷寒沙門菌，從而提示住院患者中存在傷寒病人，為臨床診斷提供方向；香港大學在社區污水中檢出病毒核酸[50]，發現多名無癥狀感染者.因此，選擇重點邊境口岸地區或高風險場所開展污水監測，基于現有的基礎設施及技術，在新冠肺炎疫情防控過程中不斷探索優化監測方案，特別是采樣點位、采樣時間和采樣頻次的設置，獲取實際應用經驗.

c)科學布局，逐步形成全國范圍的污水中病原體監測網絡.我國尚未建立系統性、全國性的污水流行病學監測網絡，嚴重制約著污水預測預警模型研究.但是，我國的城市排水系統管網在不斷優化改進，截至2020年，我國有城市污水處理廠2 618座，縣城污水處理廠1 708座，覆蓋31個省(直轄市、自治區)[87]，城市污水收集覆蓋率已達95%，為建立全國性的監測網絡奠定了基礎.污水新型冠狀病毒監測需多學科、多部門密切協作，建立健全工作機制，逐步推廣形成全國性的監測網絡.污水監測同樣適用于其他病原體(如脊灰病毒、流感病毒、諾如病毒、輪狀病毒、霍亂弧菌、沙門菌、結核分枝桿菌等)，實時掌握污水中病原體分布特征信息，了解其在我國人群中的流行特征及動態變化，助力于我國傳染病智慧化預警多點觸發機制和多渠道預測預警機制.

d)優化模型，為新冠肺炎疫情及其他傳染病流行預警提供依據.打通部門、機構間信息壁壘，實現污水中病毒核酸濃度和基因組序列的監測數據、新冠肺炎疫情流行病學數據和醫療機構的臨床監測數據等多元信息系統整合，運用機器學習、深度學習等人工智能技術，可建立新冠肺炎疫情預測預警模型，估計感染規模.不斷利用多維度的監測數據優化模型，形成智能化信息數據管理系統及大數據共享網絡，一方面應用于新型冠狀病毒監測，另一方面也為將來基于污水流行病學的病原體監測網絡提供預測預警技術平臺，將極大提升我國應對傳染病及非傳染病的預測預警、流行規模評估及精準施策的能力.