蘆筍莖皮噴霧干燥工藝優化及化學成分的超高效液相色譜-串聯質譜分析

李紫珊，衛 瑞，李震宇

(山西大學中醫藥現代研究中心，山西 太原 030000)

蘆筍(Asparagus officinalisL.)，又名石刁柏、龍須菜，為百合科天門冬屬宿根性多年生草本植物。蘆筍鮮嫩可口，富含多種營養成分，如碳水化合物、脂肪、蛋白質、維生素、硒、鋅、鐵以及礦物質等。蘆筍具有提高免疫力、燃燒脂肪、抗疲勞、保肝解毒、降血脂、抗氧化、抗衰老以及抗腫瘤等作用[1]。蘆筍在生產加工過程中會產生老莖、皮等大量的廢棄物。研究表明，這些廢棄物同樣富含黃酮和皂苷類成分，具有資源利用價值[2-3]。

噴霧干燥是近年發展起來的一種新型高效干燥工藝，可將溶液、乳液或懸浮液干燥為固體粉末或顆粒[4-5]。噴霧干燥具有制備工藝簡單、營養成分保存好、溶解性好、快速、可重現、可連續、操作方便等諸多優勢，在醫藥、食品、化工、等領域應用廣泛，且所得產品易于貯藏和運輸[6-8]。

本研究采用超高效液相-四級桿-飛行時間高分辨質譜聯用（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技術快速分析鑒定蘆筍莖皮噴霧粉中的化學成分，通過化合物的精確分子量、MS/MS裂解規律以及文獻中報道的數據等信息對噴霧粉中的化學成分進行鑒定。UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術結合了UHPLC和QTOF-MS/MS的優點，具有分辨率高、重復性好、分析時間短、準確性高等優點，廣泛應用于中藥及其復方中化學成分的鑒定[9]。

本研究以綠蘆筍生產加工過程中產生的下腳料蘆筍莖皮為原料，采用噴霧干燥技術將其制備成噴霧干燥粉，利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術快速分析鑒定噴霧粉中的化學成分，并對其溶化性、潤濕性、含水量、溶解度等理化指標進行測定，旨在將其開發成一種新型功能食品原料，提高蘆筍廢棄資源利用率，為蘆筍產業的發展和創新提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

蘆筍莖皮購買于山西省永濟市耀輝綠色蘆筍種植專業合作社；純水、甲醇等其他試劑均為國產分析純；乙腈（質譜級，美國Thermo公司），超純水由中醫藥現代研究中心制備。Milli-Q純凈水系統（美國Millipore公司）；HH-S4恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）；ZNHW電熱套（鞏義市予華儀器有限責任公司）；PX822ZH天平（奧豪司儀器有限公司）；LC-4012離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；RE5299旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SP-1500試驗型噴霧干燥機（上海順儀實驗設備有限公司）；超聲波清洗器KQ5200E（昆山市超聲儀器有限公司）,ExionLCTMAD超高效液相色譜儀；QTOF 5600+四極桿飛行時間質譜儀（美國AB Sciex公司）

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程 蘆筍莖皮→煎煮水提→真空減壓濃縮→測定可溶性固形物含量→添加輔料→調整密度→噴霧干燥→理化指標測定、化學成分分析。

1.2.2 料液的提取 采用水煎煮的方法制備蘆筍莖皮提取液。稱取一定量的藥材，第一次加入16倍量水，煎煮提取2h，過濾。在濾渣中加入10倍量水，煎煮提取2 h，過濾。將兩次的濾液合并，濃縮，備用。

1.2.3 噴霧干燥單因素試驗 對影響提取液噴霧干燥效果的主要因素，如進風溫度、進樣流量以及料液密度進行考察。

（1）進風溫度。固定進樣流量為450 mL·h-1、料液密度為1.07 g·cm-3，考察進風溫度（100、130、160℃）對噴霧粉質量的影響。

（2）進樣流量。固定進風溫度為130℃、料液密度為1.07 g·cm-3，考察進樣流量（350、450、550 mL·h-1）對噴霧粉質量的影響。

（3）料液密度。固定進風溫度為130℃、進樣流量為350 mL·h-1，通過添加麥芽糊精調節料液密度，并考察不同料液密度（1.05、1.07、1.09 g·cm-3）對噴霧粉質量的影響。

1.2.4 理化指標測定方法（1）得率。精密量取一定量提取液（mL），烘干至恒質量（g），計算提取液中固形物的含量[10]。得率計算公式如下：

產品得率=噴霧干燥出粉量（g）/（料液總固形物含量+麥芽糊精量）（g）×100%

（2）含水量。采用GB5009.3—2016中的第二法（減壓干燥法）[11]，將供試品置于真空減壓干燥箱內，設置壓力40～53 kPa，溫度（60±5）℃，烘干至前后2次質量差不超過2 mg，通過烘干前后的數值計算出含水量。

（3）溶化性。取供試品10 g，加入熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，粉末應全部溶化或輕微渾濁[12-13]。

（4）溶解度。在干燥至恒質量的10 mL離心管（最小刻度0.1 mL）中加入精密稱定的供試品0.5 g，加入沸水10 mL，攪拌振蕩5 min。噴霧粉溶解后溶液微濁，3000 r·min-1離心15 min，棄去上清液，在80℃將殘渣烘干至恒質量，精密稱定，計算溶解度[14]。溶解度計算公式如下：

溶解度=溶化顆粒質量/總顆粒質量×100%

（5）潤濕性。選取直徑為95 mm的培養皿，加入50 mL蒸餾水，水溫為25℃。在培養皿中加入2.5 g供試品，測定噴霧粉被水完全潤濕的時間（不借助任何外力，不攪拌）[15-16]。

1.2.5 質譜分析方法（1）樣品溶液的制備。取噴霧干燥粉5 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 50%甲醇溶解，超聲提取30～40 min，冷卻至室溫，濾液過0.22 μm微孔濾膜，4℃冰箱備用。

（2）色譜條件。色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3 column（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；洗脫梯度：0～10 min（2%B），10～20 min（15% B），20～25 min（25% B），25～30 min（40% B），30～32 min（80% B），32～35 min（95% B），35～39 min（2%B）；柱溫40℃；流速0.3 mL·min-1；進樣體積2 μL。

（3）質譜條件。采用正負離子模式分別進行掃描，電噴霧離子源（ESI）。離子源參數如下：噴霧電壓5500 V（正離子），-4500 V（負離子）；離子源溫度450℃；加熱氣（Gas 2）55 psi、噴霧氣（Gas 1）55 psi、氣簾氣（CUR）30 psi、去簇電壓（DP）60 V，二級碰撞能量（CE）為（40±20）eV。TOF MS一級掃描范圍為m/z 100～1500，Production scan二級掃描范圍為m/z 50～1250。

（4）化合物鑒定。查閱蘆筍相關成分研究文獻，通過與文獻中化合物的準分子離子峰、碎片裂解規律進行比對分析，在滿足質量偏差≤5條件下，最終確定化合物的結構。

2 結果與分析

2.1 噴霧干燥單因素條件的確定

由表1可知，當溫度過低時，噴霧粉水分含量大，易吸潮結塊；過高時，噴霧粉粉質較粗。當進樣流量較小時，粉質細膩、色澤呈乳白色或淡黃色、粘壁量少；過大時，噴霧粉水分含量大、粉質粗、粘壁量大、產率低。當料液密度較小時，噴霧粉水分含量高，易吸潮結塊；較大時，料液太濃、固形物和輔料容易沉淀，將機器管道堵塞。綜上所述，蘆筍莖皮噴霧干燥最優試驗條件為：流速350 mL·h-1、密度1.07 g·cm-3，溫度130℃。

表1 噴霧干燥單因素試驗結果

2.2 最優條件下制得的噴霧粉質量分析

按照上述最優條件，平行制備3批蘆筍莖皮噴霧粉，并分別對其進行外觀性狀分析和理化指標測定，測定結果如表2所示。3批噴霧粉的得率均大于50%，得率較高；含水量低；完全潤濕時間大于20 min，潤濕性小，不易吸潮，可長期儲存；溶解后無明顯雜質或沉淀，溶化性和溶解度較好；粉質細膩、顏色鮮亮、滋味獨特。

表2 噴霧粉理化指標和外觀性狀分析

2.3 基于質譜裂解途徑的蘆筍莖皮噴霧粉成分分析

目前，對于蘆筍噴霧干燥粉的工藝研究較多，但是對噴霧粉的成分分析較少，本研究利用UHPLCQ-TOF-MS/MS技術在蘆筍莖皮噴霧粉中共鑒定出38個活性成分，見表3。

表3 蘆筍莖皮噴霧粉的化學成分鑒定

2.3.1 皂苷類 在噴霧粉中共鑒定出5個甾體皂苷類化合物，其結構見圖1。其中以菝葜皂苷元為苷元的甾體皂苷，包括ShatavarinⅨ、Asparinin B、Asparagoside A和(25S)-5beta-spirostan-3beta-yl-O-[O-Alpha-L-rhamnopyranosyl-(1-4)]-Beta-Dglucopyranoside；其他類型的甾體皂苷包括Pseudoprotoneodioscin和Aspacochioside D。研究發現，蘆筍皂苷對結腸癌細胞[17]、人肝癌細胞[18]、肺癌細胞[19]以及子宮內膜癌細胞[20]等多種腫瘤細胞具有明顯的細胞毒活性，可使其凋亡或者抑制癌細胞生長。

圖1 甾體皂苷類化合物結構

以ShatavarinⅨ為例說明甾體皂苷的鑒定過程。在正離子模式下，化合物1得到準分子離子峰m/z 903.4930[M+H]+,失去一分子葡萄糖(Glc)得到m/z 741.4403[M+H-Glc]+,繼續失去一分子Glc得到m/z 579.3875[M+H-2Glc]+，再失去一分子Glc得到m/z 417.3350[M+H-3Glc]+。通過和Hayes等[21]報道的數據相比較，推測化合物1為ShatavarinⅨ。

2.3.2 黃酮類 在噴霧粉中共鑒定出8個黃酮類化合物，其苷元結構見圖2。以異鼠李素為苷元的黃酮醇苷3個，包括Isorhamnetion-3-O-rutinoside-7-Oglucoside、Narcissoside和Isorhamnetin；以山奈酚為苷元的黃酮醇苷2個，包括Camelliaside A和Kaempferol-3-O-rutinoside；以槲皮素為苷元的黃酮醇苷3個，包括Quercetin diglucoside、Quercitin 3-Oglucosylrutinoside和Rutin。研究發現，蘆筍黃酮對力竭大鼠、D-半乳糖衰老小鼠等模型具有抗氧化作用[22-23]，還可清除超氧陰離子自由基以及羥自由基[24]。

圖2 黃酮類化合物苷元結構

在正離子模式，化合物9的準分子離子峰為m/z 611.1602[M+H]+,失去一分子鼠李糖(Rha)得到m/z 465.1029[M+H-Rha]+，進一步失去一分子Glc則得到其m/z 303.0498[M+H-Rha-Glc]+。該苷元可發生裂解得到m/z 147.0646,并進一步失去一分子H2O得到m/z 129.0542。通過和對照品的保留時間以及質譜碎片相比對和Hamdi等[25]報道的數據一致，確認化合物9為Rutin。

2.3.3 氨基酸 在噴霧粉中共鑒定到8種氨基酸，其中人體必需氨基酸4種包括L-valine、Isoleucine、Phenylalanine和Methionine；非必需氨基酸4種包括Aspartic acid、L-Arginine、Histidine、Pipecolic acid。膳食氨基酸在維持健康方面發揮著重要作用，不僅可以調節機體內分泌，還是免疫代謝物和免疫遞質的主要來源[26-27]。

2.3.4 有機酸 在噴霧粉中共鑒定到8個天然有機酸，包括、Ferulic acid、Amber acid等。天然有機酸具有預防疾病和維護人體健康的功效[28]。例如，Ferulic Acid是一種酚酸類物質，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、抗糖尿病等作用，廣泛應用于醫藥、食品以及化妝品等行業[29]。

2.3.5 其他類 除了皂苷、黃酮、氨基酸和有機酸這些主要功效成分外，在噴霧粉中還鑒定出其他類化合物9個。例如，有機堿類化合物Vitamin B2，一種天然維生素，可抵抗多種疾病（如敗血癥、缺血等），同時也有助于降低人類患某些癌癥的風險[30]。Diferuoloyl glycerol是水溶性阿魏酸的甘油脂類物質，可用作食品、化妝品、化學和醫藥工業的紫外吸收劑和抗氧化劑等[31]。

3 結論與討論

進樣流量、進樣溫度、料液密度是影響噴霧干燥的主要因素[47]，本研究著重從以上3個方面考察蘆筍莖皮提取物的實驗室噴霧干燥工藝。當進樣溫度過低、進樣量過大或料液密度小、含水量大時，料液在干燥室內難以被完全干燥，顆粒容易粘在壁上，導致產率降低；溫度過高、進樣量過小，會使料液焦糖化、破壞料液中的活性成分、降低產品的營養價值和產率。Jafari等[48]試驗發現，石榴噴霧干燥粉中的花青素含量隨著溫度的升高而降低；密度過大時，料液流動性差，固形物和輔料易沉淀，容易堵塞管道、損壞機器。當進樣溫度130℃、進樣流量350 mL·h-1、料液密度1.07 g·cm-3時，蘆筍莖皮噴霧粉粉質細膩、分散、粘壁量少、含水量低、濕度小、結塊現象不明顯，產率高。按照最優工藝平行制備3批蘆筍莖皮噴霧粉，得率均大于50%，且最高可達61.31%，得率較高；溶化性較好，無明顯雜質或沉淀；溶解度均大于97%，溶解度較好；潤濕性小，不易吸潮；含水量≤7.0%,符合GB/T 29602—2013《固體飲料》國家標準，可作為長期儲存的原料。

已有研究對蘆筍莖皮的噴霧干燥工藝進行了考察，但未對其化學成分進行全面的分析和鑒定。高分辨質譜技術適用于中藥材和食品中復雜成分的快速解析，本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技術對蘆筍莖皮噴霧粉中的化學成分進行定性鑒別，共鑒定出38個化合物。其中含有皂苷類化合物5個，ShatavarinⅨ是蘆筍中具有代表性的甾體皂苷，最新研究表明其可與新型冠狀病毒（COVID-19）的蛋白酶受體SARS-CoV-2 Mpro緊密結合，抑制病毒的復制和轉錄，是一種潛在的天然抑制劑[49]；其他皂苷類化合物和Asparinin B、Asparagoside A等，同樣具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎等作用[50-51]黃酮類化合物8個,Rutin是蘆筍中具有代表性的黃酮類化合物，Kalai等[52]發現Rutin可以抑制阿爾茨海默病小鼠模型中tau的聚集以及tau寡聚物誘導的細胞毒性，降低促炎細胞因子的產生，可預防阿爾茨海默病；其他的黃酮類化合物如Narcissoside、Isorhamnetin等，對糖尿病、高血脂、冠狀病毒等也具有潛在的抑制作用[53-54]。其次，本研究還鑒定到8種氨基酸，8個有機酸、9個其他類型化合物，例如Ferulic acid，具有抗炎、抗菌、抗癌的功效，可預防疾病和維護人體健康；Vitamin B2，一種天然的維生素，可抵抗敗血癥等多種疾病；Diferuoloyl glycerol，可作為食品、醫藥、化工行業的抗氧化劑。

近年來，我國蘆筍產業發展迅速，規模和產量已經達到了全球第一。相應的，其在生產加工過程中產生的廢棄物也大量增加和積累，造成了一定的資源浪費和環境污染。通過查閱文獻筆者發現，這些蘆筍廢棄物中不僅富含脂肪、蛋白質等營養成分，同樣含有豐富的黃酮、皂苷等藥用成分，具有極其可觀的利用價值。本研究制備的噴霧粉很好地保留了蘆筍中的活性成分，具有蘆筍特有風味且營養豐富，可進一步加入其他輔料制備成固體飲料、代餐粉、泡騰片、含片等復合功能食品。