地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的靜置處理工藝優化

崔聯明，王 琳，高麗敏，郭東森，周 影，魏啟舜

（1.江蘇丘陵地區南京農業科學研究所，江蘇 南京 210046；2.江蘇開放大學 鄉村振興學院，江蘇 南京 210000）

隨著畜禽業的發展，全球每年產生羽毛廢棄物超過1000萬t[1]，我國每年羽毛廢棄物產生量也在百萬t以上。羽毛中角蛋白含量超過85%，是一種潛在的氨基酸和蛋白來源。角蛋白是一類難溶于水且富含多種氨基酸的纖維狀結構蛋白，分子鏈內和分子鏈之間存在二硫鍵、氫鍵、鹽鍵等結構，使其化學性質穩定，難以被降解利用，因此大量羽毛被填埋及焚燒，造成了嚴重的資源浪費、環境污染，甚至引起疾病[2]。因此，充分利用羽毛廢棄物不僅可以減輕環境污染，還能促進資源的循環利用。

羽毛經降解可產生氨基酸，氨基酸是參與合成蛋白質的基本分子，是保障動植物進行正常生理活動的重要組分。在農業生產中，氨基酸作為植物必須的營養元素，具有分子量小、容易被動植物吸收利用的特點，能夠有效促進作物生長、提高作物產量并改善品質[3-4]。袁祖華等[5]通過在辣椒葉面噴施氨基酸肥，辣椒的產量和品質均得到了提高。人類需要從外界獲取8種必需氨基酸，分別是：亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、色氨酸。谷氨酸鈉是最早被人類應用的氨基酸，作為味精的主要成分被廣泛應用于調味劑中。在醫藥行業中，氨基酸對許多消化道疾病、心血管病、呼吸道病等有良好的療效，且許多藥物已投入生產。徐莉英等[6]合成出了β-欖香烯氨基酸的衍生物，其被證明具有抗腫瘤活性。此外，氨基酸在水產、畜牧業中也常常作為添加劑，在保健品中也有廣泛的應用。

目前，羽毛的降解主要依靠物理法（高溫蒸煮法和膨化法）和化學法（酸堿水解法）[7]，但存在著能耗高、工藝復雜、污染環境、破壞氨基酸結構、造成產品營養損失等問題[8]。微生物法和酶解法作為2種新興的羽毛降解技術，具有過程溫和、對氨基酸破壞較小，降解效果顯著等優點。但酶解法存在成本高、單一酶降解效果不好等問題，而利用微生物直接降解羽毛步驟簡單，成本低廉，但需要對樣品的前處理和發酵工藝進行進一步優化以提高氨基酸轉化率。

先前研究篩選到一株高效羽毛降解菌地衣芽孢桿菌ZSZ6[9]，其在好氧發酵條件下，氨基酸轉化率約為19%。本研究通過優化地衣芽孢桿菌ZSZ6的發酵工藝，研究了靜置處理前的好氧培養時間、靜置溫度、還原劑預處理、添加金屬離子等對羽毛降解產氨基酸效果的影響，綜合比較了各種處理對羽毛降解氨基酸產量的影響，以期尋求最佳的靜置處理工藝。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株 地衣芽孢桿菌ZSZ6由江蘇丘陵地區南京農業科學研究所微生物實驗室篩選、保存。

1.1.2 羽毛粉 羽毛粉購自安徽文翔羽絨制品有限公司。

1.1.3 培養基 種子培養基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母粉5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1，pH值7.2～7.4；121℃下高壓滅菌20 min。羽毛粉培養基：磷酸二氫鉀1 g·L-1、磷酸氫二鉀1 g·L-1、氯化鈉1 g·L-1、羽毛粉10%，pH值7.2～7.4；在121℃下高壓滅菌20 min。所有試劑均選用商業分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 游離氨基酸含量的測定 采用茚三酮法GB/TB 314—2013。

1.2.2 好氧發酵后靜置對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，對照組CK發酵條件為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養2 d后于37℃靜置反應。測定2種處理組2～7 d的氨基酸含量。

1.2.3 好氧發酵時間對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，對照組CK發酵條件為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養0.5、1、2 d后，于37℃靜置反應。測定幾種處理組2～7 d的氨基酸含量。

1.2.4 靜置溫度對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，對照組CK發酵條件為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養2 d后，分別于37、45、55℃條件下靜置反應。于第6天測定幾種處理組氨基酸含量。

1.2.5 還原劑預處理羽毛粉對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，并分別添加1%（w/v）的二硫蘇糖醇(DTT)、巰基乙醇、Na2SO3，并將地衣芽孢桿菌ZSZ6按照5%（v/v）的接種量接種到羽毛粉培養基中，對照組CK發酵條件為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養2 d后，于55℃條件下靜置反應。第6天測定幾種處理組氨基酸含量。

1.2.6 添加金屬離子對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響 向裝液量為100 mL的羽毛粉培養基中加入5%（v/v）地衣芽孢桿菌ZSZ6，對照組CK發酵條件為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養；試驗處理組為37℃、180 r·min-1條件下搖床培養2 d后，分別添加0.1%（w/v）的FeSO4、FeCl3、CuSO4、MnSO4、MgSO4后靜置反應，并檢驗添加最優金屬離子的其他鹽類后菌株降解羽毛粉的氨基酸產量。第6天測定幾種處理組氨基酸含量。

1.2.7 50 L發酵罐條件下靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響 （1）提前泡發2組3 kg的羽毛粉，第1組不添加Na2SO3，第2組添加1%的Na2SO3，靜置過夜。

（2）將地衣芽孢桿菌ZSZ6一級種子液按照2%的比例接種到LB液體培養基中，37℃、180 r·min-1培養16 h得到二級種子液。

（3）發酵罐進行過濾器滅菌和空消后，將含有羽毛粉的羽毛培養基加入發酵罐內并加水至22 L進行實消。待冷卻至室溫后，按照5%的比例加入二級種子液進行發酵。

第1組發酵條件：控制pH值為7，攪拌轉速180 r·min-1，發酵溫度37℃，溶氧DO在20%～40%，共6 d。

第2組調整發酵條件：第一階段為菌體生長階段（48 h內），初始pH值為7，攪拌轉速180 r·min-1，發酵溫度37℃，溶氧DO控制在20%～50%；第二階段為羽毛粉降解產氨基酸階段（48 h后），調整pH值至8，溫度至55℃，加入0.1%MnSO4，并停止攪拌和通氣，每隔12 h進行1次持續15 min的攪拌，繼續發酵4 d。

1.3 數據分析

每個處理組重復3次，結果以平均值±標準差（SD）表示。采用SPSS 19和GraphPad Prism 8軟件進行數據處理、統計分析和繪圖，所有數據采用LSD方法進行多重比較，不同字母表示LSD檢驗5%水平差異顯著。

2 結果與分析

2.1 好氧發酵后靜置對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響

先前研究探究了地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛產游離氨基酸的最適發酵條件，本試驗在其基礎上探究了靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產游離氨基酸的影響。結果顯示（圖1），在整個發酵過程中，傳統的好氧發酵和好氧發酵2 d后進行靜置處理的2種發酵過程中游離氨基酸的含量均持續上升，但是靜置處理條件下氨基酸濃度上升速度明顯高于傳統好氧發酵。發酵第7天，持續好氧發酵游離氨基酸產量約為19.25 g·L-1，好氧發酵2 d后靜置處理游離氨基酸產量約為28.85 g·L-1。

圖1 傳統好氧發酵(CK)和靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響

2.2 好氧發酵時間對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響

為探究地衣芽孢桿菌ZSZ6最佳生長、產酶時間，分別將細菌培養0.5、1、2 d后進行靜置，以確定最適好氧培養時間。結果顯示（圖2），在發酵第2天，好氧發酵2 d的氨基酸濃度高于好氧發酵0.5、1 d，且在整個發酵過程中好氧發酵2 d的氨基酸濃度均高于好氧培養0.5、1 d。發酵第7天，好氧發酵0.5、1、2 d的最終氨基酸濃度分別為14.39、20.35、22.10 g·L-1。

圖2 好氧發酵時間對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響

2.3 靜置溫度對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響

不同酶類的最適溫度不同，為進一步探究地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉的最佳靜置溫度，筆者研究了3種不同靜置溫度對發酵液中氨基酸含量的影響。結果顯示（圖3），在發酵第6天，于55℃靜置條件下氨基酸濃度明顯高于37℃和45℃靜置。這表明在好氧發酵2 d的條件下，55℃是最適降解溫度，推測原因可能是地衣芽孢桿菌ZSZ6所產的角蛋白酶在該條件下能保持較高的酶活。

圖3 靜置溫度對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響

2.4 還原劑預處理羽毛粉對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響

適當的預處理能夠使角蛋白更易降解，因此，筆者研究了3種還原劑1%（w/v）的DTT、巰基乙醇、Na2SO3對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響。結果顯示（圖4），使用1%的Na2SO3預處理羽毛粉夠明顯提升氨基酸的濃度，達到29.22 g·L-1，比對照提高約11%。使用1%DTT和巰基乙醇進行預處理則會降低氨基酸濃度。

圖4 還原劑預處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響

2.5 添加金屬離子對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響

金屬離子可能對酶活性存在一定影響，不同的金屬離子會對酶產生促進或者抑制作用。本試驗研究了在好氧培養階段后、在靜置之前，添加不同金屬離子對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響。結果顯示（圖5），FeSO4、FeCl3、CuSO4、MnSO4、MgSO4對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸均有一定提高，其中MnSO4提升量最大，在第6天達到約35.41 g·L-1，比對照（26.23 g·L-1）提高了約35%。此外，本研究驗證了MnSO4、MnCl2、Mn(NO3)2對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響（圖6）。結果顯示，不同錳鹽之間并沒有表現出差異。這表明錳鹽對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸產生的影響主要是依賴于錳離子。

圖5 金屬離子對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響

圖6 不同錳鹽對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響

2.6 50 L發酵罐條件下靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的影響

為進一步檢驗靜置處理在擴大化處理的情況下是否能提高氨基酸的產量，筆者研究了在50 L發酵罐水平下靜置處理對羽毛粉降解產氨基酸的影響。結果如圖7所示，2個處理組在2～5 d的時間內氨基酸濃度均有所提高，但靜置處理組的提高速度遠大于對照組。在測量的6 d內，CK組生產氨基酸在第6天達到峰值，約為17.51 g·L-1；靜置組在第5天可以達到峰值，約為39.50 g·L-1。由此可見，即使在擴大化處理的復雜情況下，靜置處理仍然能夠大幅提高氨基酸產量。

圖7 50 L發酵罐水平下靜置處理對地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸效果的影響

3 結論與討論

角蛋白的空間結構存在著很多的氫鍵、二硫鍵、疏水鍵等強相互作用，形成了復雜的三維超螺旋結構，使角蛋白的結構復雜而緊密，難以被降解，部分還原劑有助于促使角蛋白中二硫鍵的斷裂，加速角蛋白的降解[10]。角蛋白酶是一種可降解水不溶性角蛋白的酶，其來源于一些具有角蛋白降解活性的細菌、真菌、放線菌。目前已報道的可以降解羽毛角蛋白的微生物種類繁多，研究表明地衣芽孢桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌、梭狀芽孢桿菌[11]、枯草芽孢桿菌[12]等降解羽毛的效果顯著，且與角蛋白酶的活性密切相關。張昕[13]通過對枯草芽孢桿菌的發酵培養基及發酵條件的優化，在72 h羽毛降解率為69.61%；發酵液的氨基酸含量達22.66 mg·mL-1；周蓮等[14]通過對解淀粉芽孢桿菌3-2發酵羽毛的發酵工藝優化，在108 h氨基酸總含量達到20.861 g·kg-1。本研究對地衣芽孢桿菌ZSZ6進行發酵工藝優化，搖瓶條件下在第6天氨基酸含量可達35.41 g·L-1，高于其他菌株發酵效果，實現了氨基酸產量的大幅提升。

羽毛降解產氨基酸主要依賴于角蛋白酶，而角蛋白酶的活性受到多種因素影響。一般認為，微生物在降解羽毛時會產生多種酶類聯合降解角蛋白。Williams[15]研究了一株從厭氧條件下分理處的地衣芽孢桿菌，發現其好氧生長快于厭氧生長，而在厭氧條件下降解角蛋白積累氨基酸的能力優于好氧條件。這一結果和筆者得到的結果相一致（圖1），推測原因可能是在好氧發酵過程中，地衣芽孢桿菌ZSZ6可能會利用部分氨基酸替代羽毛粉進行生理活動，導致體系中氨基酸含量的減少；而靜置處理造成了厭氧的環境條件，使好氧菌正常生長代謝降低，減少了對氨基酸的消耗。因此，在細菌生長繁殖、產酶達到一定程度后，進行靜置處理能夠有效提高體系中氨基酸的含量。不同微生物分泌的角蛋白酶的最適溫度存在一定差異，常見的角蛋白酶最適溫度在35～60℃之間。地衣芽孢桿菌ZSZ6在37℃，180 r·min-1培養2 d時，體系中細菌數量和酶活均達到了最適宜降解羽毛粉的條件（圖1、圖2），并在55℃靜置時氨基酸產量最高（圖3）。大部分金屬離子都會對角蛋白酶活存在一定影響，如Mg2+、Ca2+、Mn2+對很多角蛋白酶有促進作用，而Zn2+、Cu2+、Hg2+等對部分角蛋白酶表現出較強的抑制作用[16-17]。本研究中Mn2+極大的提高了氨基酸的產量，且Cu2+和Fe3+也有一定的提升作用（圖5、圖6）。還有研究表明，一些還原劑如DTT、巰基乙醇、亞硫酸鈉等可以提高角蛋白酶的活性[18]，而本研究中DTT、巰基乙醇對氨基酸的產量有明顯的抑制作用（圖4），推測原因可能是3種還原劑可以加速羽毛中二硫鍵斷裂，但是DTT和巰基乙醇會對地衣芽孢桿菌ZSZ6生長產生抑制作用，而Na2SO3則不會影響對細菌產生負面影響。

本研究初步探究了靜置處理下地衣芽孢桿菌ZSZ6對降解羽毛粉產氨基酸的影響，并進一步優化了降解條件，提高了游離氨基酸產量。通過單因素試驗考察外加靜置處理前的好氧培養時間、靜置溫度、還原劑預處理、添加金屬離子等對羽毛降解產氨基酸效果的影響。結果表明，經1%Na2SO3預處理的羽毛粉，在37℃、180 r·min-1好氧發酵2 d后，添加0.1%MnSO4并置于55℃條件下靜置處理，在優化條件下發酵6 d，產物中的游離氨基酸含量可達35.41 g·L-1（比對照組提高約84%），轉化率約35%（比對照組提高約16%），極大地提高了氨基酸產量，這表明靜置處理是一種能夠有效提高地衣芽孢桿菌ZSZ6降解羽毛粉產氨基酸的方法，后續研究需要進一步優化其在羽毛降解上的應用。