葉酸受體陽性循環腫瘤細胞檢測對早期肺癌的診斷價值

陳鵬飛 謝金標 楊天寶 王 武 陳 豪 黃國忠

莆田學院附屬醫院心胸外科，福建莆田 351100

據中國國家癌癥中心（ChinaNationalCancerCenter，NCC）公布的最新癌癥數據[1]，我國常見的癌癥類型包括肺癌、結直腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌，占比超過總癌癥類型的50%。肺癌是中國最常見的癌癥，如果在早期發現并進行手術切除，預后良好，5 年生存率達到70%～90%。然而，大多數患者（約75%）在確診時已是晚期（Ⅲ/Ⅳ期）[2]。因此，對肺癌患者盡早實施診斷和治療對患者的預后尤為關鍵。目前，肺部結節良、惡性的臨床診斷方法是血液學檢測（腫瘤標志物）、影像學檢查（胸部CT）等。其中，化驗腫瘤標志物的指標在肺癌和癌前病變中，癌胚抗原、腫瘤相關糖類抗原、細胞角蛋白片段等的表達率均不高，從而對臨床診斷的準確性產生一定的影響。影像學檢查如發現肺部小結節，患者對手術治療的態度不明確，未能按時治療，患者常常會錯失最佳手術時機[3]。循環腫瘤細胞為患者機體的腫瘤細胞自發從原發腫瘤和轉移灶或者侵入性操作導致釋放入血，腫瘤細胞在循環中聚集，形成微小的瘤栓，在適宜條件下形成轉移灶[4]。葉酸受體在肺癌細胞中表達率高，本研究探討早期肺癌患者葉酸受體陽性的臨床療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年9 月至2021 年12 月莆田學院附屬醫院收治的100 例疑似肺癌患者作為研究對象，其中男57 例，女43 例；年齡44～79 歲，平均（62.16±2.51）歲。納入標準：①臨床表現不典型，只有咳嗽、胸悶、低熱等呼吸道表現，胸部CT 表現為疑似肺癌的單一肺結節（最大直徑＜3 cm），沒有縱隔淋巴結腫大或其他轉移；②所有患者知情且自愿參與本研究，臨床資料完整。排除標準：①CT 顯示肺部多個結節，并伴發轉移；②包括外科和放射治療患者，或者是肺部腫瘤復發患者[5]。本研究經醫院醫學倫理委員會批準同意（2019090），患者和家屬均簽署研究知情同意書。

1.2 方法

所有患者抽取3 ml 肘前靜脈血，含有EDTA 的試管用于靜脈血的保存，儲存溫度：4℃，檢測時間：葉酸受體陽性的循環腫瘤細胞檢測在24 h 后進行。首先采用3 ml 血液中的免疫磁性微球負向富集方法，采用配體PCR 技術對其進行定量檢測，上海格諾思博生物技術有限公司為其提供的檢測試劑盒，并嚴格按照試驗試劑盒的使用方法進行操作[6]，用4 倍于3 ml 的紅細胞溶解液，于4℃溶解15 min，除去紅細胞，再加入150 μl 抗CD45 微球，于4℃培養30 min，除去白細胞；將抗CD14 微粒50 μl 于4℃培養30 min，將巨噬細胞剔除；將采集到的循環腫瘤細胞添加10 μl的具有腫瘤特異性的葉酸配體-寡核苷酸偶合物的探針標記液，在室溫孵育40 min，然后添加1 ml 的清洗緩沖溶液，在4℃下進行10 min 的離心，以1500 r/min 的速度，離心半徑15 cm，反復3 次，以除去未結合的探頭；最后，添加120 μl 的洗脫緩沖溶液，4℃培養2 min，將結合的探頭洗脫出來，離心收集，加入中和緩沖液24 μl，進行熒光PCR 擴增，利用ABI7300 儀器（美國愛普拜斯公司）采集PCR 信號和數據[7-8]。在此基礎上，ABI7300 儀器在95℃變性2 min、40℃退火30 s、72℃延長30 s、8℃5 min 完成；40 次熱處理后，95℃變性10 s、35℃退火30 s、72℃延伸10 s。在3 ml 的血液中，發現1 個循環中的葉酸受體陽性細胞，即1 FU[9]。

1.3 觀察指標

記錄100 例患者中的早期肺癌、肺良性結節患者的例數，葉酸受體陽性循環腫瘤細胞計數及該檢測方法在臨床診斷的靈敏度、特異度。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并采用Kappa 一致性檢驗分析診斷價值，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 早期肺癌患者和肺良性病變患者葉酸受體陽性腫瘤細胞的比較

結合患者的病理診斷結果，有75 例早期肺癌患者，25 例肺良性病變患者，早期肺癌患者的葉酸受體陽性腫瘤細胞為（11.38±1.37）FU/3 ml，高于肺良性病變患者的（8.10±1.83）FU/3 ml，差異有統計學意義（t=9.495，P＜0.05）。

2.2 葉酸受體陽性循環腫瘤細胞檢測診斷早期肺癌的價值

以術后病理結果作為診斷肺癌的金標準，Kappa一致性檢驗顯示葉酸受體陽性循環腫瘤診斷早期肺癌具有一定的準確性（Kappa=0.683，P＜0.05）；以葉酸受體陽性循環腫瘤細胞作為肺癌的診斷指標，ROC曲線下面積為0.810（95%CI=0.648～1.000），最佳截斷值為8.7 FU/3 ml，靈敏度為87.7%，特異度為76.9%（圖1）。

圖1 葉酸受體陽性循環腫瘤細胞檢測診斷價值的ROC 曲線

3 討論

肺癌患者的人數越來越多，病情嚴重，具有很高的死亡率，嚴重威脅患者的生命安全。因此，對肺癌患者做到早診斷和早治療尤為重要。隨著居民對體檢意識認知性的提高，肺結節的臨床診斷率越來越高，但結節的性質、能否手術影響著患者及家屬的決定[10]。

腫瘤標記物在早期肺癌的診斷中，臨床參考價值較小，診斷意義不大。而外周血中腫瘤細胞的檢測在臨床上也有一定的局限性，目前，尚沒有一種標準的方法來進行檢測[11]。早期的循環腫瘤細胞可以顯示出腫瘤細胞的形狀，而循環腫瘤細胞的檢測則是基于不同的細胞形態，對腫瘤各項數據進行分析，而不需要對細胞表面的信息進行檢測，其優勢在于不依賴于循環中的腫瘤細胞表面抗原，且其形態和活性保持不變，但其純度非常低，容易失去直徑較小的循環腫瘤細胞[12-14]。

葉酸受體在肺癌細胞的表達性很高，因此，葉酸受體陽性的循環腫瘤細胞檢測是最理想的檢測手段。通過保真放大、實時檢測PCR 分子，實現雙層次放大，最終完成對3 ml 血液樣本中循環腫瘤細胞的檢測，對檢測的靈敏度有很大的改善[15]。在本研究中，通過對100 例疑似肺癌患者實施檢測，比較早期肺癌的臨床診斷中早期肺癌及良性肺結節患者的葉酸受體陽性循環腫瘤細胞，結果顯示，葉酸受體陽性循環腫瘤細胞更高，早期肺癌患者的葉酸受體陽性腫瘤細胞含量高于肺良性病變細胞，差異有統計學意義（t=9.495，P＜0.05），同時檢測Kappa 值為0.683，AUC為0.810，最佳截斷值為8.7 FU/3 ml，靈敏度為87.7%，特異度為76.9%，具有一定的臨床診斷價值。本研究結果與唐興等[16]的研究結果一致，具有參考價值。

綜上所述，葉酸受體陽性循環腫瘤細胞在早期肺癌的臨床診斷中靈敏度較高，能夠作為診斷早期肺癌的有效標記物，明確肺癌患者的具體情況，在臨床上具有較高的應用價值，值得臨床推廣應用。