甘草次酸的差向異構體對順鉑誘導H9c2心肌細胞損傷的保護機制

馬治，王欣爽，劉玥，魏麗萍，齊新△

隨著現代醫療技術的進步，癌癥患者生存期顯著延長，心血管疾病已成為癌癥患者最常見的非癌癥死亡原因［1］。化療是抗腫瘤治療的常用方法之一，但多種化療藥物引起的心臟毒性可增加癌癥患者心力衰竭的風險［2］。鉑類化療藥物作為廣譜抗腫瘤藥物應用廣泛，近年來其誘發的急慢性臟器毒性備受關注，研究鉑類化療藥物心臟毒性發生發展機制，對減輕鉑類化療患者心臟毒性和提出防治策略具有重要意義。中藥在改善化療藥物不良反應方面有積極意義。甘草具有良好的抗炎、抗氧化作用，對心臟、肝臟、大腦等多個臟器具有保護作用［3］。甘草酸作為甘草中的有效活性成分，在體內水解為甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）發揮藥理作用。研究發現，GA能直接作用于心肌細胞發揮保護作用［4-6］。由于甘草酸18位手性碳原子的構型不同，存在一對差向異構體，即18α-甘草酸和18β-甘草酸，兩者經水解后可生成相應18α-甘草次酸（18α-GA）和18β-甘草次酸（18β-GA）［7］。兩種構型的甘草次酸親水性不同，在體內發揮作用效果也存在一定差異［8］。本研究應用18α-GA和18β-GA分別對順鉑（cisplatin，CDDP）作用的H9c2心肌細胞進行干預，探究其緩解CDDP誘導心肌細胞損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料H9c2心肌細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；CDDP、18β-GA購自MedChem Express公司；18α-GA購自美國sigma公司；胎牛血清購自依科賽生物科技有限公司；DMEM培養基購自美國Gibco公司；0.25%胰酶、CCK-8試劑盒、活性氧（ROS）檢測試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Hoechst33258凋亡染色試劑盒、Mito-Tracker Red CMXRos試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗B-淋巴細胞瘤基因-2（Bcl-2）抗體購自Affinity公司；兔抗Bcl-2相關X蛋白（Bax）、細胞色素C（Cyt-c）抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔抗剪切化胱天蛋白酶3（C-Caspase3）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自北京博奧森生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；CO2培養箱（美國Thermo公司）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Western blot電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 細胞培養及分組

1.2.1 細胞培養H9c2細胞培養于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基中，置于37℃，5%CO2培養箱中進行培養。待H9c2心肌細胞生長至80%融合度時，將細胞以1∶3的比例進行傳代。根據細胞生長狀況，每周換液2~3次。

1.2.2 CDDP毒性濃度篩選分組對照組采用0 μmol/L的CDDP處理，其他組分別使用1、5、10、20、40、60 μmol/L的CDDP孵育24 h。藥物干預結束后，棄去舊培養基，加入含有10%CCK-8溶液的DMEM培養基孵育2 h，于酶標儀450 nm波長處檢測吸光度。

1.2.3 18α-GA和18β-GA安全濃度篩選分組對照組采用0 μmol/L的18α-GA和18β-GA處理，其他組分別加入3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的18α-GA和18β-GA孵育24 h。篩選18α-GA和18β-GA的安全濃度，方法同1.2.2。

1.3 CCK-8法檢測心肌細胞活力將細胞隨機分為對照組（正常培養細胞）、CDDP組（加入20 μmol/L CDDP）、18α-GA低劑量組（加入20 μmol/L CDDP和3.125 μmol/L 18α-GA）、18α-GA中劑量組（加入20 μmol/L CDDP和50 μmol/L 18α-GA）、18α-GA高劑量組（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18α-GA）、18β-GA低劑量組（加入20 μmol/L CDDP和3.125 μmol/L 18β-GA）、18β-GA中劑量組（加入20 μmol/L CDDP和50 μmol/L 18β-GA）、18β-GA高劑量組（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18β-GA），分別干預細胞24 h后進行CCK-8實驗，選定18α-GA和18β-GA濃度進行后續實驗。

1.4 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡將細胞隨機分為對照組（正常培養細胞）、CDDP組（加入20 μmol/L CDDP）、18α-GA組（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18α-GA）、18β-GA組（加入20 μmol/L CDDP和100 μmol/L 18β-GA）。將細胞接種于六孔板內，加入藥物干預24 h后，使用PBS溶液洗滌3遍，加入0.5 mL固定液，固定20 min，用PBS將固定液清洗干凈。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，搖床染色5 min，PBS洗凈染色液。使用熒光顯微鏡檢測細胞凋亡情況。

1.5 流式細胞術檢測ROS含量各組藥物干預24 h后吸棄含有藥物培養基，離心收集細胞，使用預冷的PBS清洗細胞。按照1∶1 000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。加入適當稀釋好的探針，用無血清細胞培養液洗滌細胞1~2次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。于流式細胞儀上檢測細胞熒光強度。使用FlowJoVX分析實驗結果。

1.6 Mito-Tracker Red CMXRos染色檢測線粒體活性 各組進行藥物干預后，棄去細胞培養板中原有的培養液，加入配制好的Mito-Tracker Red CMXRos工作液，37℃孵育20 min。棄掉Mito-Tracker Red CMXRos工作液，加入37℃預溫的新鮮細胞培養液，于熒光顯微鏡下觀察熒光強度。采用Image J的MINA分析線粒體網絡形態。

1.7 Western blot檢測各組細胞中C-Caspase3、Bcl-2、Bax、Cyt-c蛋白表達水平 各組加入含有PMSF的RIPA裂解液，提取蛋白，BCA法測蛋白濃度。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，PVDF轉膜；5%脫脂牛奶室溫搖床封閉2 h。抗體孵育：封閉結束，將一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶2 000）、CCaspase3（1∶1 000）、Cyt-c（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）分別按比例進行稀釋，4℃搖床過夜。取出一抗，TBST搖床洗膜3次。加入二抗（1∶10 000）室溫搖床孵育2 h，TBST搖床洗膜3次。避光條件下采用化學發光法進行顯色。采用Image J軟件進行蛋白定量分析。

1.8 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料采用±s表示。符合方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey?s檢驗；不符合方差齊性檢驗，多組間比較采用Welch檢驗，多重比較采用Dunnett?s T3檢驗。不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，多重比較采用Tukey?s檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 18 α-GA及18β-GA對CDDP誘導的心肌細胞活力的影響CCK-8結果提示，CDDP呈劑量依賴性引起心肌細胞活力降低，與0 μmol/L相比，20 μmol/L的CDDP顯著降低心肌細胞活力（P＜0.01），且細胞活力在50%左右，見圖1。與0 μmol/L相比，3.125、6.25、12.5、25、50及100 μmol/L的18α-GA和18β-GA對H9c2心肌細胞活力差異無統計學意義，見圖2。與CDDP組相比，18α-GA和18β-GA低劑量組細胞活力差異無統計學意義，18α-GA、18β-GA中劑量組和高劑量組均可改善CDDP導致的心肌細胞活力的降低（P＜0.01），見圖3。本研究采用20 μmol/L的CDDP、100 μmol/L的18α-GA和18β-GA進行后續實驗。

Fig.1 Effects of CDDP on viability of H9c2 cardiomyocytes圖1 CDDP對H9c2心肌細胞活力的影響

Fig.2 Effects of 18α-GA and 18β-GA on the viability of H9c2 cells圖2 18α-GA和18β-GA對H9c2心肌細胞活力的影響

Fig.3 Effects of low,medium and high doses of 18α-GA and 18β-GA on cisplatin-induced myocardial cell viability圖3 18α-GA及18β-GA低、中、高劑量對CDDP誘導心肌細胞活力的影響

2.2 18 α-GA及18β-GA對CDDP誘導的心肌細胞凋亡情況影響與對照組相比，CDDP組細胞凋亡明顯，細胞數量減少，細胞核呈致密濃染且碎片狀，藍色熒光著色深；與CDDP組相比，18α-GA組和18β-GA組細胞形態規則、數量增多，且細胞核基本呈彌散、均勻的藍色熒光。見圖4。

2.3 18 α-GA及18β-GA對CDDP誘導的心肌細胞ROS含量的影響對照組、CDDP組、18α-GA組和18β-GA組相對ROS含量分別為1.00±0.05、5.81±0.40、0.69±0.07和0.62±0.08，組間差異有統計學意義（n=4，F=196.432，P＜0.01）。與對照組相比，CDDP組ROS含量增加（P＜0.01）；與CDDP組相比，18α-GA組和18β-GA組細胞內ROS含量降低（P＜0.01）。見圖5。

2.4 18 α-GA及18β-GA對順鉑誘導的心肌細胞線粒體活性的影響與對照組相比，CDDP組心肌細胞內線粒體足長度和具有網狀結構的線粒體數量明顯降低（P＜0.05）；與CDDP組相比，18α-GA組和18β-GA組線粒體足長度和具有網狀結構的線粒體數量明顯增加（P＜0.05），見圖6、表1。

Fig.4 Effects of 18α-GA and 18β-GA on CDDP-induced apoptosis of cardiomyocytes(Hoechst staining,×400)圖4 18α-GA及18β-GA對CDDP誘導的心肌細胞凋亡的影響（Hoechst染色，×400）

Fig.5 Effects of 18α-GA and 18β-GA on ROS content in cardiomyocytes induced by cisplatin圖5 18α-GA和18β-GA對順鉑誘導心肌細胞ROS含量的影響

Fig.6 Effects of 18α-GA and 18β-GA on mitochondrial activity of cardiomyocytes induced by CDDP(×400)圖6 18α-GA和18β-GA對CDDP誘導心肌細胞線粒體活性的影響（×400）

Tab.1 Comparison of mitochondrial foot length and number of mitochondria with reticular structure between the four groups表1各組細胞線粒體足長度和具有網狀結構的線粒體數量比較 （n=6）

2.5 18 α-GA及18β-GA對順鉑誘導的線粒體相關凋亡蛋白表達的影響與對照組相比，CDDP組CCaspase3、Cyt-c蛋白表達水平升高，Bcl-2/Bax蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與CDDP組相比，18α-GA組和18β-GA組的C-Caspase3和Cyt-c蛋白表達水平降低，Bcl-2/Bax蛋白表達水平升高（P＜0.05）。見表2、圖7。

Tab.2 Comparison of protein expression levels of CCaspase3,Bcl-2/Bax and Cyt-c between the four groups表2各組C-Caspase3、Bcl-2/Bax、Cyt-c的蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of CCaspase3,Bcl-2/Bax and Cyt-c between the four groups表2各組C-Caspase3、Bcl-2/Bax、Cyt-c的蛋白表達水平比較 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組相比，b與CDDP組相比，P＜0.05。

組別對照組CDDP組18α-GA組18β-GA組F C-Caspase3 1.06±0.40 2.15±0.40a 1.30±0.28b 1.30±0.35b 10.321＊＊Bcl-2/Bax 1.00±0.15 0.50±0.04a 0.97±0.18b 0.88±0.09b 9.768＊＊Cyt-c 0.97±0.41 2.66±0.22a 1.11±0.25b 0.57±0.04b 36.039＊＊

3 討論

腫瘤心臟病學作為一門新生交叉學科，在過去十年中取得了重大進展并形成國際專家共識［9］。國際指南對放化療及靶向藥物的心血管毒性及防治提供了臨床指導。抗腫瘤藥物產生的心臟毒性反應是腫瘤心臟病學的主要研究內容之一，如放化療引起的心功能改變、化療后心肌損傷導致生物標志物的變化以及心律改變等［10］。鉑類化療藥在對抗實體瘤方面具有良好的效果，然而隨著使用時間與劑量的增加，機體可出現不同程度的心臟毒性反應。本研究發現，CDDP干預H9c2心肌細胞可使心肌細胞活力呈劑量依賴性下降。20 μmol/L的CDDP可致心肌細胞活力下降至50%左右，且細胞發生凋亡。

Fig.7 Effects of 18α-GA and 18β-GA on CDDP-induced mitochondrial-related apoptostic protein expression in cardiomyocytes圖7 18α-GA和18β-GA對CDDP誘導的心肌細胞線粒體相關凋亡蛋白表達的影響

多種中藥提取物應用于臨床可起到多通路多靶點的心臟保護作用。研究發現，GA能夠減少心肌梗死面積、改善室性心律失常，并可保護心肌細胞免受缺氧缺糖誘導的損傷［11］。然而，GA能否對CDDP誘導的心肌細胞損傷發揮保護作用尚不明確。本研究結果顯示，＜100 μmol/L的18α-GA和18β-GA對心肌細胞活力無明顯影響，進一步研究發現，50 μmol/L和100 μmol/L的18α-GA及18β-GA均可提升CDDP造成的心肌細胞活力的下降，且在100μmol/L時效果較好。Hoechst 33258凋亡染色結果提示，100 μmol/L的18α-GA和18β-GA均可有效抑制CDDP誘導的心肌細胞凋亡。

鉑類化療藥物產生的臟器毒性反應一般是多重因素共同作用所致，如DNA損傷、氧化應激、炎癥反應以及細胞相關凋亡通路的發生等。多項研究表明氧化應激在順鉑誘導心臟毒性中發揮重要作用［12-14］。在CDDP誘導的細胞毒性中，ROS生成的增加是重要因素［15］。少量的ROS可對細胞發揮有益作用，然而大量的ROS過度堆積將對細胞產生有害的影響，特別是激活細胞凋亡通路。ROS過度積累可改變線粒體膜電位并破壞呼吸鏈，最終觸發凋亡。同時，線粒體是ROS的主要產出場所，線粒體損傷也可導致ROS的不斷產生，形成惡性循環。抑制ROS的產生可有效緩解CDDP導致的心肌損傷。研究發現GA可通過抑制ROS與細胞凋亡對心肌細胞發揮一定的保護作用［16-17］。本研究結果顯示，在CDDP作用下的H9c2心肌細胞內ROS水平較對照組明顯增加，在給予18α-GA和18β-GA處理24 h后可顯著降低CDDP誘導的心肌細胞ROS的產生。

研究發現，CDDP給藥后可在線粒體內快速蓄積，使線粒體結構和功能發生改變，最終導致細胞凋亡［18］。線粒體介導的內源性凋亡是參與CDDP誘導細胞凋亡的主要形式［19］。當細胞發生凋亡時，包括ROS在內的應激信號將調控線粒體膜通透性，此時線粒體外膜上的Bcl-2的表達降低，使得線粒體膜通透性增高，存在于胞漿內的Bax可被轉移到線粒體，結合在線粒體外膜形成線粒體凋亡通道，導致Cyt-c釋放，激活Caspase級聯反應［20］。為探究18α-GA和18β-GA能否改善CDDP引發的線粒體功能障礙，筆者對線粒體相關指標進行檢測。結果顯示，與對照組相比，CDDP組細胞具有網狀結構的線粒體數量和線粒體足長度明顯降低，說明具有生物活性的線粒體減少，線粒體碎片增多，同時線粒體相關蛋白Bcl-2/Bax的表達降低，引起線粒體膜通透性的增高，導致Cyt-c的外泄，引起Caspase3激活；經過18α-GA和18β-GA干預后線粒體網絡結構明顯增加，線粒體碎片的產生減少，Bcl-2/Bax的表達升高，線粒體生物活性提高，抑制Cyt-c的外排以及Caspase3的表達。以上結果表明18α-GA和18β-GA可以改善線粒體功能，對CDDP誘導的心肌細胞損傷發揮保護作用。

綜上，18α-GA和18β-GA可抑制ROS的生成并改善心肌細胞線粒體功能障礙，減輕CDDP對H9c2心肌細胞的損傷作用。GA在體的心肌保護作用需要進一步的實驗研究。