活性炭逆轉利伐沙班對凝血試驗干擾的效果評價

陸松松，李夢，奴爾扎特·胡爾曼，丁慶明，徐秦竹，宋英，蘇明△

利伐沙班是一種口服抗凝藥（direct oral anticoagulants，DOACs），在血栓性疾病的預防和治療領域應用廣泛［1］。有研究顯示，利伐沙班可使凝血酶原時間（PT）和活化部分凝血活酶時間（APTT）明顯延長［2］。即使在患者血漿中的DOACs濃度較低時仍有可能干擾凝血試驗，導致臨床上對患者凝血功能的誤判。為避免血漿樣本中殘留的DOACs對凝血試驗的影響，一般需要在最后給藥后延遲3 d或更長時間進行檢測才能獲得真實的凝血試驗結果。近年研究顯示，活性炭能夠吸附檢測血漿樣本中的DOACs，從而逆轉DOACs對體外凝血試驗檢測的影響，且活性炭自身對凝血試驗影響較小［3］。但也有研究發現并非所有含有此類藥物的血漿樣本都可被活性炭完全逆轉［4］。目前國內活性炭逆轉利伐沙班對凝血試驗干擾的相關研究較少。本研究通過觀察活性炭對不同質量濃度利伐沙班血漿的吸附效果，分析活性炭在凝血試驗中排除利伐沙班影響的有效性，并就該方法在臨床應用中的實踐價值進行探討。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及分組選取2021年5—9月于北京大學人民醫院體檢中心體檢的人群。納入標準：近3個月無抗凝及止血用藥史，無糖尿病、高血壓、腦血管疾病、心臟病、惡性血液病、實體腫瘤病史；血常規、肝腎功能檢測無異常。取臨床常規凝血項目檢測后的枸櫞酸鈉抗凝血樣本，每次方便抽取20例，重復24次，共納入480例，男213例，女267例，年齡22~64歲，平均（39.8±7.8）歲。所有抗凝血樣本室溫2 000 r/min離心15 min，獲得乏血小板血漿（血小板計數＜10×109/L）。將20例血漿樣本（每例0.25 mL）混合配制成正常混合血漿（NPP）5 mL，取1 mL NPP為N1組；另取1 mL NPP經活性炭處理后為N2組：10 mg醫用活性炭（400目，北京邁瑞達科技有限公司）和1 mL血漿在EP管中混合5 min，2 000 r/min離心2 min后將上清液轉移到另1個EP管中再次2 000 r/min離心2 min，取上清液即活性炭處理的血漿；N3組為NPP加入利伐沙班標準品（CAS NO 366789-02-8，國家標準物質資源平臺）使利伐沙班理論終質量濃度分別為100、200、300、400 μg/L，記為N3A組、N3B組、N3C組和N3D組，每份終體積為1 mL，每個質量濃度重復6次。N4組為N3組經活性炭處理（方法同前）。所有樣本在采樣后4 h內完成檢測。

收集同期急診科首次使用利伐沙班治療的患者22例，男15例，女7例，年齡51~82歲，平均（63.4±5.2）歲。首次服用利伐沙班前6 h采集血樣為S1組，服用利伐沙班后6 h采集血樣為S2組。所有樣本室溫2 000 r/min離心15 min，獲得乏血小板血漿。S2組經活性炭處理后（由于樣本量有限，處理方法為5 mg活性炭處理500 μL血漿，方法同N2組）為S3組。每份患者血漿樣本量均為500 μL，所有樣本在采集后4 h內完成檢測。本研究方案符合赫爾辛基宣言，并經北京大學人民醫院倫理委員會批準（批準文號：2020PHB409-01）。

1.2 液相色譜-聯用串聯質譜（HPLC-MS/MS）測定利伐沙班質量濃度取N3組及S2組血漿50 μL，加入甲醇（HPLC級）180 μL混合去蛋白質，添加利伐沙班內標。將血漿混勻5 min，-80℃冷凍60 min保存，檢測前室溫融化后，3 000 r/min離心5 min，將上清液轉移到350 μL樣本管中。使用液相色譜系統UltiMate 3000 RS（Dionex，Sunnyvvale，加利福尼亞）與三 重 四 極 桿6500串 聯 質 譜 儀（AB Sciex，Foster City，California）進行HPLC-MS/MS測定利伐沙班質量濃度。

1.3 凝血試驗及凝血因子活性檢測 使用凝血分析系統（型號ACL TOP 700，美國IL公司）及其配套試劑檢測N1、N2、N3、N4組PT、APTT、凝血酶時間（TT）及纖維蛋白原（FIB）水平，蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）以及凝血因子FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性，N1、N2、N3、N4、S1、S2和S3組抗Xa因子（Anti-Xa）活性。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行數據分析，通過Kolmogorov-Smirnov法檢驗數據的正態性，符合正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用Tamhane's T2法；非正態分布的數據以中位數和四分位數［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Friedman檢驗，組間多重比較采用Wilcoxon檢驗。相關性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 活性炭和利伐沙班對凝血試驗及凝血因子活性的影響與N1組比較，N2組PT、APTT、INR、FIB、PC、PS、AT-Ⅲ、Anti-Xa、FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性差異無統計學意義；N3組PT、APTT延長，INR、PS、AT-Ⅲ和Anti-Xa活性升高，FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性降低（P＜0.05），FIB水平及PC活性差異無統計學意義；N4組APTT延長，PS、FⅤ、FⅧ、FⅪ、FⅫ活性降低（P＜0.01），PT、INR、FIB水平，AT-Ⅲ、Anti-Xa、FⅡ、FⅦ、FⅨ、FⅩ活性差異無統計學意義。與N3組比較，N4組PT、APTT縮短，INR水平，PS、AT-Ⅲ和Anti-Xa活性明顯降低，FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ、FⅫ活性升高（P＜0.01），FIB水平和PC活性差異無統計學意義，見表1。

2.2 利伐沙班對患者Anti-Xa和APTT的影響與S1組比較，S2組Anti-Xa活性升高，APTT延長；S3組APTT延長（P＜0.01），Anti-Xa活性差異無統計學意義。與S2組比較，S3組Anti-Xa活性降低，APTT縮短（P＜0.01），見表2。

2.3 利伐沙班質量濃度對凝血試驗及凝血因子活性的影響N3A、N3B、N3C和N3D組PT、APTT、INR、PS水平及Anti-Xa活性逐次升高，FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅪ活性逐次降低（P＜0.01）；N3C和N3D組FⅡ、FⅩ和FⅫ活性均低于N3A組，AT-Ⅲ活性高于N3A（P＜0.01），見表3。

2.4 利伐沙班質量濃度與Anti-Xa活性相關性分析N3組利伐沙班質量濃度與Anti-Xa活性呈正相關（rs=0.989，P＜0.01）。S2組利伐沙班質量濃度［55.64（16.78，109.44）μg/L］與Anti-Xa活性呈正相關（rs=0.969，P＜0.01）。

3 討論

利伐沙班作為一種DOACs已廣泛應用于臨床預防血栓，但由于目前對利伐沙班藥物濃度或活性的監測并未普及，因此其在臨床中引發的出血事件逐漸顯現［5-7］。利伐沙班作為口服的活性藥，其血藥濃度的達峰值時間是4 h，但體外直接將利伐沙班溶于血漿，可立即起效。研究表明，體外血漿中的利伐沙班藥物活性在室溫可穩定8 h［8］，其藥理機制為結合血漿中活化的FⅩ（FⅩa），使凝血酶原酶不能順利合成［9］，最終導致凝血酶不能被激活，從而預防血栓形成。因此，利伐沙班對采用凝固法檢測的凝血試驗有相同的作用，可干擾試驗中凝血酶的生成，導致APTT和PT延長，凝血因子活性假性降低，PS活性假性升高［10-12］。本研究通過在NPP中加入利伐沙班以及對口服利伐沙班患者血漿進行凝血試驗，結果與既往研究基本一致。隨著利伐沙班的濃度升高，PT、APTT延長，INR、PS活性及Anti-Xa活性假性升高，FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅪ活性假性減低；N3C和N3D組FⅡ、FⅩ和FⅫ活性均低于N3A組，AT-Ⅲ活性高于N3A，N3A組與N3B組AT-Ⅲ活性差異無統計學意義，表明AT-Ⅲ活性檢測在利伐沙班濃度發生較大變化時才會受到影響。AT-Ⅲ檢測方法為發色底物法，利伐沙班可直接結合AT-Ⅲ檢測試劑中的FⅩa，因此可能導致AT-Ⅲ活性假性升高。此外，本研究也證實利伐沙班對PC及FIB的檢測沒有影響，因PC檢測為采用發色底物法直接檢測血漿中PC的含量，而FIB的檢測是通過記錄試劑中凝血酶將血漿中FIB變成纖維蛋白的時間來測定FIB的活性，這2項檢測均無FⅩa的參與，不受利伐沙班的影響。

Tab.1 Comparison of coagulation test indexes and activity of coagulation factors between the four groups表1各組凝血試驗指標及凝血因子活性比較 ［n=24，M（P25，P75）］

Tab.2 Comparison of Anti-Xa level and APTT between the three groups表2 S1、S2和S3組Anti-Xa活性和APTT比較［n=22，M（P25，P75）］

活性炭表面的微孔直徑大多為2～50 nm，每克活性炭的表面積為500～1 500 m2，具有較強的吸附功能［13］，且其吸附能力主要針對小分子的化學物質，而血漿中的蛋白質由于分子質量較大，不能通過活性炭的孔徑［14］。本研究比較NPP中加入活性炭前后的凝血指標變化（N1組與N2組），結果顯示活性炭對凝血因子沒有吸附能力，其本身對凝血試驗沒有影響。臨床已有活性炭膠囊用于治療藥物過量時吸附體內藥物的案例［15-17］。國外的大多數研究為應用基于活性炭的商品化試劑盒（DOAC-REMOVE，DOAC-STOP）在體外去除利伐沙班［3-4］，國內目前尚無成品的試劑盒可以應用。本研究中，課題組選用常規的醫用活性炭（400目）進行應用研究，N4組與N1組Anti-Xa活性差異無統計學意義，且與N3組比較，N4組所有檢測項目的水平均明顯逆轉，證實活性炭具有去除利伐沙班的能力。通過S3組與S1組比較，服用利伐沙班后的血漿經過活性炭處理，Anti-Xa活性與服藥前無差異，可見口服方式進入循環系統的利伐沙班同樣可被活性炭吸附。

在Anti-Xa活性檢測尚未完全普及的情況下，臨床在觀察利伐沙班活性時監測PT會比APTT更為敏感［18］。但本研究的主要目的是觀察活性炭是否可以有效吸附血漿中的利伐沙班，由于N4組的APTT較N1組延長，而2組間PT差異無統計學意義，因此，在首次服用利伐沙班患者樣本量有限的情況下，本研究選擇APTT進行檢測，發現在服用利伐沙班患者血漿經活性炭處理后，APTT水平較服藥前6 h延長，其具體機制需要進一步研究，如活性炭是否會吸附APTT檢測試劑中的磷脂而引起APTT變化。

Tab.3 Comparison of coagulation indexes and activity of coagulation factors between the four groups表3 N3A、N3B、N3C和N3D組凝血實驗及凝血因子活性比較 （n=6）

在臨床工作中，筆者曾多次發現患者應用利伐沙班后PT和（或）APTT明顯延長，此時若進行凝血因子活性檢測，可表現為多個凝血因子活性降低，易造成誤導，甚至影響臨床決策。若實驗室可以明確凝血指標異常是否由藥物引起，以及預測藥物代謝后患者凝血指標水平變化，則可以協助臨床做出更準確的處置，對臨床治療有重要的指導意義。再者，若延長的PT和（或）APTT可通過活性炭糾正，也能避免繼續檢查PT和（或）APTT相關的凝血因子活性、狼瘡抗凝物和凝血因子抑制物，節省醫療資源。本研究中利伐沙班的最高質量濃度為400 μg/L，實際活性炭的處理能力可能遠高于此濃度。若血漿中藥物濃度較高，考慮一次活性炭處理未能完全吸附，可以重復處理的步驟，直至完全去除為止。

盡管目前的檢測系統中Anti-Xa活性的檢測是通過肝素來定標，但本研究應用此檢測系統結果可見Anti-Xa活性與利伐沙班質量濃度呈正相關，其相關系數在N3組中為0.989，在S2組為0.969。因此，針對肝素定標的Anti-Xa活性分析同樣可以用于檢測利伐沙班，與既往研究一致［19-20］。本研究主要探討活性炭對利伐沙班的吸附作用，而既往研究［3-4］顯示，活性炭可能會對其他口服的抗凝藥物有類似的吸附效果，如在臨床應用中筆者曾嘗試采用活性炭去除血漿中的達比加群酯，效果同樣顯著，但缺乏大樣本的重復實驗；然而，華法林抗凝機制為抑制維生素K依賴的FⅡ、FⅦ、FⅨ、FX的生成［21］。因此，活性炭即使可以吸附華法林，也不能改變FⅡ、FⅦ、FⅨ、FX生成減少引起的凝血指標異常。

綜上所述，本研究證實活性炭能有效去除血漿中的利伐沙班，逆轉由利伐沙班引起的異常凝血指標。但本研究中沒有考慮活性炭是否對凝血檢測試劑中的磷脂有吸附作用，且多數研究中，并沒有區分患者服用利伐沙班的品牌，因此對不同品牌口服利伐沙班之間是否有區別需要進一步研究。