醒腦靜聯合納洛酮對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究

余柳燕 雷 娜 解宇環 郭沛鑫

云南中醫藥大學，云南 昆明 650500

急性酒精中毒是指機體短期內攝入過量乙醇，導致中樞神經系統出現先興奮后抑制的狀態[1]。在臨床接診中，急性酒精中毒的接診率高達67.08%，根據中樞神經系統損傷程度將其分為興奮期、共濟失調期及昏迷期[2-3]。流行病學調查[4]結果顯示，酒精性昏迷已成為昏迷發生的三大主因之一。急性酒精性昏迷是酒精中毒的重度階段，如何快速有效地對昏迷患者進行促醒治療并減輕并發癥，改善預后是臨床急診醫學關注的重點。

醒腦靜注射液是經典方安宮牛黃丸基礎上縮減而來，由梔子、冰片、麝香、郁金四味藥組成，梔子性寒味苦，有清熱解毒之功，現代藥理研究[5]發現，梔子苷具有抗炎、解熱、利膽的作用 ；冰片引藥上行，主通竅散郁，可增強中樞的缺氧耐受力[6]；麝香芳香走竄，可開竅醒神，麝香酮可興奮中樞神經系統及呼吸系統，增強腦血流，保護神經元[7]；郁金則行氣止痛，清心解郁，可降低血漿β-EP水平，減輕氧化應激反應引起的器官損害[8]。臨床上常用醒腦靜注射液治療腦血管疾病、腦外傷、急性中毒、病毒感染引起的昏迷[9]。研究[10]發現，單用醒腦靜在治療急性酒精中毒時，其發揮的療效和納洛酮相近，且臨床應用安全，不良反應少。與納洛酮聯合應用治療急性酒精中毒的患者時，療效肯定，但作用機制不明確。

研究[11]發現，過量乙醇攝入會導致認知功能障礙與腦結構損傷，乙醇對嚙齒類動物的影響主要是破壞空間記憶能力。另外，研究[12]證實了乙醇可通過誘導氧化應激及神經炎性反應等途徑導致學習記憶功能障礙。目前臨床治療急性酒精性昏迷，療效明確、使用頻率較高的是阿片受體拮抗類藥物。此外，常用中藥注射液有醒腦靜、清開靈等?；A研究[13]發現，單用納洛酮時，對應激狀態下亞急性酒精中毒大鼠學習記憶損害有一定的改善作用；在臨床研究中，常用納洛酮聯合醒腦靜治療昏迷患者[14-15]，但聯合用藥與二藥單獨應用的療效對比及對認知功能改善有何異同，尚無相關實驗研究。該研究的缺乏極大地局限了聯合用藥的推廣和應用。本研究擬采用腹腔注射乙醇溶液的方式建立急性酒精性昏迷大鼠模型，通過觀察醒腦靜與納洛酮單用和二者聯合用藥時各組大鼠昏迷評分變化，RCS評分可反映大鼠昏迷程度，RCS評分越低，大鼠昏迷程度越深。明確促醒的作用，并利用水迷宮觀察大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數及目標象限停留所占百分比等記憶功能的變化，以此來評價二藥聯用時促醒作用的特點，可為臨床用藥提供實驗支持。

1 實驗材料

1.1 藥物 醒腦靜注射液(批號：2106042)，購于大理藥業股份有限公司；鹽酸納絡酮注射液(批號：2010015)，購于山東新華制藥股份有限公司。根據臨床人用劑量，按照人與大鼠體表面積折算法，分別將鹽酸納絡酮和醒腦靜注射液用生理鹽水配制為0.2 mg/mL與5.48 mg/mL濃度，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，購于北京斯貝福實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。于云南中醫藥大學SPF級實驗動物中心飼養，溫度(22±2)℃，相對濕度為40%～55%，室內光暗循環12 h，自由飲水，進食。

1.3 試劑 無水乙醇(批號：20211001420)，購于天津市致遠化學試劑有限公司；生理鹽水(批號：210326 2B)，購于西安京西雙鶴藥業有限公司。

1.4 儀器 DB001型Morris水迷宮，北京智鼠多寶股份有限公司生產；BCD-392MNE型4 ℃冰箱，由青島海爾股份有限公司生產。

2 方法

2.1 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模濃度摸索 取健康SD雄性大鼠24只，隨機分為32%、34%、52% 3個乙醇濃度組，每組8只動物，分別腹腔注射上述不同濃度乙醇，注射容積為16 mL/kg，觀察造模后大鼠的耐受性和昏迷程度，參照由格拉斯哥昏迷評分量表(glasgow coma scale， GCS)改良的大鼠昏迷評分量表(表1)進行昏迷程度評分。評分內容包括眼瞼刺激反應、腦干反射、翻正反射、聽覺刺激以及胡須運動等方面，評分為0～3分時判斷大鼠進入昏迷狀態;評分為10～13分時判斷大鼠為清醒狀態。選擇合適的乙醇濃度進一步考察給藥容積。

表1 大鼠昏迷評分量表(RCS)

2.2 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模體積摸索 根據上述實驗中的結果確定的乙醇造模濃度，取健康SD雄性大鼠24只，分別用15 mL/kg、16 mL/kg、17.8 mL/kg乙醇溶液腹腔注射后，對翻正反射消失的大鼠同法參照表1大鼠昏迷評分量表(RCS)進行昏迷程度評分。每只動物持續觀察300 min，每隔30 min進行昏迷評分1次，記錄大鼠的昏迷時長及昏迷程度。

2.3 醒腦靜聯合納洛酮對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究 取健康雄性SD大鼠40只，適應性喂養5 d后，隨機分為5組，分別為空白組、模型組、醒腦靜注射液組(20 mL/kg)、鹽酸納絡酮注射液組(0.9 mL/kg)及醒腦靜聯合納洛酮注射液組(20 mL/kg+0.9 mL/kg)，每組6只，除空白對照組外，其余各組采用32%乙醇以17.8 mL/kg劑量腹腔注射，復制急性酒精中毒昏迷大鼠模型，造模后隨即于另一側腹腔注射給藥。在造模給藥后，采用RCS表(表1)對各組大鼠進行昏迷評分。每隔30 min進行一次評分，評分直到第5 h，動物基本蘇醒后，停止評分。

2.4 大鼠Morris 水迷宮實驗(MWM) 取健康雄性SD大鼠50只，適應性喂養結束后，進行水迷宮實驗，水迷宮直徑1.6 m，高50 cm，水面沒過平臺(直徑20 cm)1 cm左右，水深30 cm，水溫(25±1)℃。大鼠造模前對大鼠進行為期5 d的定位航向訓練，將大鼠依次從四個象限放入水中，若90 S后還未找到平臺，便引導大鼠進入平臺，停留10 S，若90 S內找到平臺，則進行下一只鼠的訓練。訓練第6天，動物同法分組、造模、給藥，在給藥后第12 h，進行探查訓練。撤去平臺，記錄大鼠進入平臺的時間、進入次數及目標象限停留時間所占百分比。實驗裝置如圖1所示。

圖1 Morris水迷宮圖

3 結果

3.1 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模濃度摸索 實驗結果發現，34%與52%濃度乙醇給大鼠腹腔注射后均出現動物死亡，死亡率分別為12.5%和75%，32%乙醇腹腔注射，動物均出現翻正反射消失，但未見動物死亡。因此，本研究選擇32%濃度乙醇作為急性酒精性昏迷大鼠的乙醇造模濃度。實驗結果見表2。

表2 不同濃度乙醇對大鼠死亡率的影響>

3.2 急性酒精性昏迷大鼠乙醇造模體積摸索 實驗結果表明，采用32%的乙醇溶液，以17.8 mL/kg腹腔注射造模，大鼠昏迷評分最低，部分大鼠在造模3 h后翻正反射開始恢復，在造模后5 h，大鼠基本恢復清醒，較符合急性酒精昏迷的臨床表現。后續正式實驗選用該濃度和體積的乙醇溶液復制急性酒精中毒昏迷大鼠模型。結果見表3、圖2。

表3 不同給藥體積對大鼠昏迷評分及昏迷時長的影響

3.3 醒腦靜聯合納洛酮對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究 實驗結果表明，32%乙醇造模后，0 h時各組大鼠RCS評分在2.5～3分之間，隨著時間推移，評分逐漸升高，造模4.5 h后，模型組大鼠RCS評分恢復至正常大鼠水平。

注:與15 mL/kg組比較，**P<0.01

與模型組比較，納洛酮組在造模1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h后評分明顯增高(P<0.05，P<0.01)，醒腦靜組在造模1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h后，評分明顯增高(P<0.05，P<0.01)，醒腦靜聯合納洛酮用藥組動物蘇醒較快，在造模給藥后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h評分明顯增高(P<0.05，P<0.01)。與納洛酮組比較，聯合用藥組及單用醒腦靜組大鼠恢復清醒時間較納洛酮組提前了1 h(評分≥10)，聯合用藥組療效略優于單用醒腦靜組。

實驗結果表明，醒腦靜與納絡酮聯合用藥，對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用優于醒腦靜和納絡酮單獨用藥。結果見表4。

3.4 大鼠Morris 水迷宮實驗(MWM) 實驗結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)，穿越平臺次數及目標象限停留時間明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，醒腦靜組、醒腦靜+納絡酮聯合用藥組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.01)，目標象限停留百分比明顯增加(P<0.01)，醒腦靜組、納洛酮組、醒腦靜+納絡酮聯合用藥組大鼠穿越平臺次數明顯增加(P<0.05，P<0.01)。與納洛酮相比較，聯合用藥組及醒腦靜組大鼠逃避潛伏期明顯減少(P<0.01)，目標象限停留百分比明顯增加(P<0.01)，聯合用藥組穿越平臺次數明顯增加(P<0.01)。實驗結果提示，醒腦靜聯合納洛酮用藥，對急性酒精性昏迷大鼠的學習記憶功能障礙改善明顯優于醒腦靜和納絡酮單獨用藥。結果如圖3、圖4所示。

表4 醒腦靜聯合納洛酮對急性酒精性昏迷大鼠的促醒作用研究

注:與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與納洛酮組比較，&&P<0.01。圖3 大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數及目標象限停留所占百分比的影響圖

圖4 大鼠水迷宮軌跡圖

4 討論

現代藥理研究[16]發現，醒腦靜注射液可通過調節覺醒肽-腺苷神經功能促進酒精昏迷大鼠覺醒。納絡酮為阿片類受體拮抗藥，其促醒機制與藥物取代β-EP與嗎啡受體結合，解除其對中樞神經系統的抑制狀態有關[17]。臨床上常用醒腦靜聯合納洛酮治療急性酒精中毒導致的昏迷，療效肯定，但作用機制不明確。

本研究先運用在格拉斯哥昏迷評分量表(GCS)基礎上改良得來的大鼠昏迷評分量表(RCS)對酒精中毒大鼠昏迷程度進行評價，評分越低，表明大鼠昏迷程度越深，連續時間內測評，可動態反映大鼠昏迷程度變化。經過預實驗證實，32%的乙醇以17.8 mL/kg給大鼠腹腔注射，大鼠昏迷評分在0～3分內，昏迷時長為(3±0.5)h，且無動物死亡，與臨床急性酒精中毒昏迷的臨床表現一致性較好，故選擇該劑量酒精可快速且安全的復制大鼠昏迷模型。

Morris水迷宮是作為嚙齒類動物空間學習與記憶的經典行為學實驗方法，通過強迫實驗動物(如大鼠、小鼠)游泳，學習尋找目標象限隱藏平臺，可測試實驗動物對空間位置及空間定位的學習及記憶能力，在學習記憶機制[18]、藥物開發及阿爾茨海默癥、血管性癡呆、帕金森及腦外傷等各類疾病模型[19～20]的評價中被廣泛應用。該系統主要由定位航向實驗與空間探索實驗兩部分組成。其中逃避潛伏期、穿越平臺次數及目標象限停留百分比等常作為評價其空間探索能力的指標。本研究選用了Morris水迷宮中的空間探索行為學指標評價醒腦靜聯合納洛酮對昏迷恢復后大鼠的記憶功能的改善作用。實驗結果表明，酒精中毒昏迷大鼠蘇醒后，逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數與目標象限停留百分比減少，而聯合用藥對大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留所占百分比均優于單用醒腦靜或納洛酮組，提示聯合用藥可改善急性乙醇導致的大鼠學習記憶功能下降。

本實驗以32%乙醇17.8 mL/kg腹腔注射建立急性酒精中毒昏迷大鼠為研究對象，實驗結果表明，醒腦靜、納洛酮及二者聯合用藥均可提高大鼠昏迷評分，單用醒腦靜作用略優于單用納洛酮，二者聯用時，昏迷評分最高，表明醒腦靜聯合納洛酮可明顯縮短大鼠昏迷時長，改善機體意識與運動功能障礙，療效優于單用醒腦靜和單用納絡酮；酒精中毒昏迷大鼠蘇醒后，逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數與目標象限停留百分比減少，而聯合用藥對大鼠逃避潛伏期、穿越平臺次數、目標象限停留所占百分比均優于單用醒腦靜或納洛酮組，提示聯合用藥可改善急性乙醇導致的大鼠學習記憶功能下降。

因此，醒腦靜、納洛酮、二者聯合用藥均可不同程度發揮促醒作用，其中聯合用藥促醒效果最佳，醒腦靜組在改善大鼠昏迷評分及記憶功能方面均優于單用納洛酮，為進一步明確單獨用藥與聯合用藥各自發揮促醒作用的機制，后續將進一步開展藥物促醒作用的機制研究。