龜茸壯骨片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究

高英鑫，徐 偉，張衍旭，王野諶，張 雷，祝雨婕，董雪蓮*

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春130117；2.吉林省中研藥業(yè)有限公司，吉林 長春130062)

龜茸壯骨片(WS-5947-(B-0947)-2002)是吉林省中研藥業(yè)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的省級獨家品種，由鹿茸、龜甲(醋制)、骨碎補、補骨脂、續(xù)斷5味中藥組成，具有溫陽補腎、益髓壯骨的作用[1-3]，在臨床上常用于治療中老年人筋骨痿軟的輔助用藥。按照原國家食品藥品監(jiān)督管理局相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，目前龜茸壯骨片中以補骨脂素為對照通過薄層掃描法進行含量測定，以柚皮苷為對照通過薄層鑒別作為質(zhì)量控制。上述質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)過于簡單，難以全面反映和控制龜茸壯骨片的質(zhì)量。中藥復(fù)方制劑是由多種有效成分組成，經(jīng)多靶點、多途徑發(fā)揮功效，且各味藥間經(jīng)整合而實現(xiàn)其有利于機體的特定終末效應(yīng)[4]，多指標(biāo)成分測定已成為質(zhì)量評價的主要發(fā)展趨勢[5]。龜茸壯骨片中骨碎補具有療傷止痛、補腎強骨的作用[6-7]，主要成分柚皮苷是一種黃酮單體物質(zhì)，具有抗炎和抗氧化作用[8]，可在促進骨形成的同時，抑制骨破壞[9-10]。補骨脂具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效[11]，其主要成分補骨脂素和異補骨脂素是兩種呋喃香豆素類化合物[12]，可促進成骨細胞增殖和分化成熟，并抑制其凋亡[13-14]。此兩味藥組成臨床治療骨質(zhì)疏松的常用聯(lián)合藥對，二者強強聯(lián)合，可從多角度對骨損傷進行修補。本研究在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)文獻所用方法[14]，以多指標(biāo)成分測定入手，建立續(xù)斷和補骨脂的薄層鑒別方法和骨碎補、補骨脂中柚皮苷、補骨脂素、異補骨脂素含量測定的高效液相色譜法，旨在為龜茸壯骨片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和改進提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超聲波提取器(功率 250 W、頻率 50 kHz，型號為KH-250B)；高效液相色譜儀(型號為1260，配備DAD紫外檢測器)；電子分析天平[十萬分之一(MS105DU型)與萬分之一(EL204型)]。

1.2 藥品與試劑

續(xù)斷對照藥材(購買于上海源葉生物科技有限公司)，薄層板(G，10 cm×10 cm)，川續(xù)斷皂苷、柚皮苷、補骨脂素、異補骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國食品藥品檢定研究院；龜茸壯骨片(20201101、20201102、20201103、20201104、20201105)及陰性樣品均由吉林省中研藥業(yè)有限公司提供；甲醇為分析純；乙酸和甲醇均為色譜純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 續(xù)斷薄層鑒別

取龜茸壯骨片5片，除去糖衣，研細待用。取1 g粉末按2020版《中國藥典》“續(xù)斷”項下薄層方法進行鑒別。將薄層板置于烤板機加熱后，可觀察到有斑點顯現(xiàn)。在供試品色譜中，在與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點。且陰性無干擾，具有良好的專屬性，表明所用方法可用于龜茸壯骨片中續(xù)斷的鑒別。見圖1。

圖1 龜茸壯骨片中續(xù)斷薄層鑒別

2.2 補骨脂薄層鑒別

取龜茸壯骨片5片，除去糖衣，研細待用。取粉末2 g按2020版《中國藥典》“續(xù)斷”項下薄層方法進行鑒別。將展開劑比例調(diào)節(jié)為正丁烷-乙酸乙酯(2∶1)，噴以顯色劑后可觀察到在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。且陰性沒有出現(xiàn)干擾，具有良好的專屬性，表明所用方法可用于龜茸壯骨片中補骨脂的鑒別。見圖2。

圖2 龜茸壯骨片中補骨脂薄層鑒別

2.3 補骨脂素、異補骨脂素、柚皮苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ZXRBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：0.05%乙酸溶液-甲醇(65∶35)等度洗脫；柱溫：25 ℃；檢測波長：246 nm(用于檢測補骨脂素及異補骨脂素)、284 nm(用于檢測柚皮苷)；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL[12]。

2.3.2 溶液的制備 (1)對照品溶液的制備。精密稱取各對照品制成每1 mL混合對照品含柚皮苷0.055 9 mg、補骨脂素0.018 1 mg、異補骨脂素0.016 2 mg的混合溶液。

(2)供試品溶液的制備。取龜茸壯骨片粉末2.5 g，加適量甲醇加熱回流提取3 h，放至室溫，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻后濾過即得。

(3)陰性供試品溶液的制備。取缺骨碎補、缺補骨脂的陰性樣品，按與供試品相同的方法制備即得。

2.3.3 方法學(xué)驗證 (1)專屬性試驗。對混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液進樣，記錄色譜圖。觀察發(fā)現(xiàn)，供試品色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的保留時間處均有相對應(yīng)的色譜峰，分離度良好，無雜質(zhì)峰干擾，陰性樣品無干擾。見圖3。

注：A.混合對照品；B.供試品溶液；C.補骨脂陰性對照；D.骨碎補陰性對照；E.空白溶液。1.柚皮苷；2.補骨脂素；3.異補骨脂素。

(2)線性關(guān)系考察。精密稱取柚皮苷對照品加甲醇制成濃度分別為0.465 836、0.372 669、0.186 334、0.093 167、0.046 584、0.023 292 mg/mL的溶液。補骨脂素對照品液加甲醇制成濃度分別為0.108 123、0.058 976、0.032 437、0.016 219、0.009 829、0.004 915 mg/mL的溶液。異補骨脂素對照品加甲醇制備成濃度分別為0.101 189、0.050 595、0.025 297、0.020 238、0.010 119、0.005 059 mg/mL的溶液。按“2.3.1”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)線性關(guān)系考察發(fā)現(xiàn)，所制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

(3)耐用性試驗。取同一份供試品溶液，分別在不同條件下，按照不同色譜條件進樣測定，計算柚皮苷、補骨脂素、異補骨脂素含量RSD。結(jié)果表明，所用方法耐用性良好，見表2。

表2 各成分耐用性試驗結(jié)果 (mg/g)

(4)穩(wěn)定性試驗。精密吸取同一供試品溶液及混合對照品溶液各5 μL，分別于配制后的 0、1、2、4、6、8、10、12、14、24 h 按“2.3.1”項下色譜條件進行測定(表3)。觀察發(fā)現(xiàn)，龜茸壯骨片供試品溶液及對照品溶液中的柚皮苷、補骨脂素、異補骨脂素3個待測成分在室溫下放置 24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 各成分24 h穩(wěn)定性試驗結(jié)果 (%)

(5)重復(fù)性試驗。精密稱取龜茸壯骨片樣品(批號20201103)2.5 g，平行制備6份供試品測定含量。結(jié)果表明，所用方法重復(fù)性較好,見表4。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果

(6)加樣回收率試驗。精密稱定已知含量的龜茸壯骨片樣品(批號20201103)6份，每份1.25 g 。分別加入與樣品中待測成分含有量相當(dāng)?shù)膶φ掌泛筮M行測定，記錄峰面積，計算回收率。結(jié)果表明，所用方法回收率符合要求，見表5。

表5 加樣回收率試驗結(jié)果 (n=6)

(7)精密度試驗。精密吸取混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣6次，測定，記錄峰面積，計算RSD。結(jié)果柚皮苷峰面積的RSD(n=6)為0.19%；補骨脂素峰面積的RSD(n=6)為0.26%；異補骨脂素峰面積的RSD(n=6)為0.35%。表明所用方法與本儀器的精密度良好。

2.3.8 樣品含量測定 取5批不同批次龜茸壯骨片制備供試品溶液，并進行含量測定，記錄色譜圖，結(jié)果見表6。

表6 樣品的含量測定結(jié)果 (mg·g-1)

3 討論

本實驗對龜茸壯骨片部分標(biāo)準(zhǔn)進行了修訂與提高研究，對原標(biāo)準(zhǔn)中未列入的薄層色譜鑒別項的藥材進行了薄層色譜研究，在龜甲與鹿茸的薄層鑒別中，因其為動物藥成分較為復(fù)雜且不易被提取導(dǎo)致薄層鑒別不穩(wěn)定且很難重現(xiàn)，故決定不將二者薄層方法納入質(zhì)量提升標(biāo)準(zhǔn)之中。續(xù)斷的薄層色譜重現(xiàn)性、專屬性好，陰性無干擾，故可列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)正文。在補骨脂的薄層方法研究中，改良了藥典中展開劑的比例，以保證所測物質(zhì)的斑點分離得更好且處于薄層板中央易于觀察。在含量測定方法的探索中，選擇HPLC法以雙波長同時測定三種成分，可以更快更好地對質(zhì)量進行一定控制。在探索階段前期，利用DAD檢測器的全波長特點進行考量，最終選出最大吸收波長。并依次對柱溫、提取方式、提取方法進行考量，對流動相的比例、進樣量對峰型及分離度進行考察，最終確定穩(wěn)定可靠、簡潔便利的質(zhì)量控制方法，并納入標(biāo)準(zhǔn)正文。本研究成果可用于龜茸壯骨片的質(zhì)量控制，可為保障其臨床用藥的安全性和有效性提供保障。