靈芝菌絲體中三萜及甾醇含量測定方法研究

孫國強，董金穎，董建生，郜晉陽

(山西瑞芝生物科技有限公司，山西 運城 044000)

靈芝(Ganodermalucidum)也叫瑞草、仙草等，為名貴的藥用真菌[1]。現代研究表明，其具有調節免疫力、抗腫瘤、抗衰老、保肝、提高機體耐缺氧能力等活性[2-6]。靈芝子實體和菌絲體中均含蛋白質、核苷類、糖類、三萜類、甾醇類、生物堿、揮發油等多種化學活性成分。其中，三萜類化合物是其主要有效成分之一，靈芝是傳統的藥食同源品種之一[2，4，7]。《中國藥典》采用紫外-可見分光光度法對靈芝中三萜及甾醇含量進行測定[8]。

由于通過液體或固體發酵技術獲取靈芝三萜類化合物具有生產周期短、不受季節影響、可大批量生產、含量相對穩定等特點，現已成為生產靈芝三萜類化合物的最有效方法[9-10]。當前，市場上有眾多靈芝菌絲類產品，其宣傳的保健功能與靈芝類似，但三萜及甾醇等主要活性成分的檢測方法尚未有統一的國家標準[11-12]。目前，國內外對靈芝子實體、菌絲體和孢子中三萜的研究較多，但菌絲體中三萜及甾醇含量的相關報道較少[9]。本研究較系統地建立了靈芝菌絲體中三萜及甾醇的含量檢測方法，以期為靈芝菌絲類產品質量標準制定及產品深度開發提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

1.1.1 靈芝菌絲粉 靈芝菌絲粉由山西瑞芝生物科技有限公司培養的靈芝菌絲體，經再干燥粉碎后制備。

1.1.2 齊墩果酸對照品 齊墩果酸對照品,批號：110709-201808，中國食品藥品檢定研究院。

1.1.3 主要試劑 香草醛(批號：20150701，國藥集團化學試劑有限公司)、冰醋酸(批號：181128，四川西隴科學有限公司)、95%乙醇(批號：180619，四川西隴科學有限公司)、乙酸乙酯(20170308，四川西隴科學有限公司)、甲醇(批號：20180307，廣東光華科技股份有限公司)、高氯酸(批號：2017034，天津市鑫源化工有限公司)，均為分析純；水為雙蒸水。

1.2 主要儀器

UV-1100紫外/可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；AL204電子天平(瑞士梅特勒公司)；HH-S4數顯恒溫水浴鍋(常州市國旺儀器制造有限公司)；DK-615HTD超聲波清洗器(深圳市得康洗凈電器有限公司)。

2 方法與結果

紫外-可見分光光度法[8，12-16]常用于靈芝類產品中三萜及甾醇含量測定，本研究選用此法，對其在靈芝菌絲粉中三萜及甾醇含量測定的適用性進行系統研究。

2.1 5%香草醛-冰醋酸制備

精密稱取0.501 02 g香草醛，加冰醋酸溶解并定容至10 mL，混勻，臨用新配。

2.2 齊墩果酸對照品溶液制備

精密稱取齊墩果酸對照品0.011 60 g，加甲醇溶解且定容至50 mL，即得0.211 4 mg·mL-1的齊墩果酸標準溶液。

2.3 供試品溶液制備

取本品粉末約1 g(m1)，精密稱定，置具塞錐形中，加乙醇30 mL，超聲處理45 min，濾過，濾液置50 mL(V1)量瓶中，用適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 空白制劑溶液制備

精密稱取約1 g混合均勻的空白制劑，按“2.3”項下供試品溶液制備方法，同法制備，即得。

2.5 樣品測定

精密量取供試品溶液0.2 mL(V2)，置15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，在70℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應試劑為空白，按紫外-可見分光光度法，在546 nm波長處測定吸光度A，由標準曲線上計算出樣品測定液中三萜及甾醇質量m(mg)，計算，即得。

三萜及甾醇含量計算公式：

式中：X：樣品中三萜及甾醇含量[g/100 g]；m1：樣品取樣量(g)；V1：樣品定容體積(mL)；V2：量取供試品溶液體積(mL)；m：樣品測定液中三萜及甾醇的質量(mg)。

2.6 測定波長選擇

精密量取“2.2”項下齊墩果酸對照品溶液0.2 mL，按“2.5”項下方法處理即得標準品測定液，將標準品測定液與“2.4”項下空白制劑溶液于紫外分光光度計500～700 nm波長范圍進行紫外掃描，記錄紫外掃描圖(見圖1)。

圖1 標準品、空白溶液紫外掃描圖

從圖1可以看出，齊墩果酸標準品在547 nm處有最大特征吸收峰，而空白制劑溶液在(546±2) nm波長處無吸收。這表明本品選擇546 nm作為測定波長具有專屬性，空白制劑溶液對檢測結果無干擾。

2.7 方法學考察

2.7.1 線性關系 精密量取濃度為0.211 4 mg·mL-1的齊墩果酸對照品溶液0 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL(相當于葡萄糖0.000 00 mg、0.021 14 mg、0.042 28 mg、0.063 42 mg、0.084 56 mg、0.105 70 mg、0.126 84 mg、0.147 98 mg、0.169 12 mg)分別置入15 mL具塞試管中，按照“2.5樣品測定”項方法處理且測定吸光度，結果見表1。

表1 線性關系檢測結果

以齊墩果酸質量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，見圖2。

圖2 齊墩果酸線性范圍標準曲線

從圖2可以得到，線性方程為y=10.496x-0.022 4，R2=0.999 3。這表明三萜及甾醇質量在0～0.169 12 mg范圍內線性關系良好。

2.7.2 精密度試驗 按“2.7方法學考察”平行稱取6份供試品，測定并計算三萜及甾醇含量，結果見表2。

表2 精密度試驗結果

從表2可以看出，6份供試品的三萜及甾醇平均含量為2.402 2%，RSD為0.73%<2%，這表明此方法精密度良好。

2.7.3 穩定性考察 精密稱取本品1.065 41 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，后按“2.5樣品

測定”項方法處理，處于室溫下放置，1 h 內每隔10 min測定1次吸光度值，后續于2、4、6、8、12 h各測定1次吸光度值，結果見表3。

表3 供試品溶液穩定性考察結果

以測定時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制穩定性考察曲線圖，見圖3。

圖3 供試品溶液穩定性考察曲線

結合表3、圖3看出，供試品溶液吸光度值在1 h內基本穩定，RSD為0.23%<2%，1 h后吸光度值顯著升高，穩定性明顯下降，因此配置好的供試品溶液應在1 h內完成吸光度測定。

2.7.4 準確度考察 分別平行精密稱取已知三萜及甾醇含量約為2.4%的樣品3組，每組約0.5 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液。每組分3管，共9管，各取0.2 mL供試品溶液。第一組按供試品溶液所含三萜及甾醇質量的約50%添加“2.2”項下齊墩果酸對照品、第二組按供試品溶液所含三萜及甾醇質量的約100%添加“2.2”項下齊墩果酸對照品、第三組按供試品溶液所含三萜及甾醇質量的約150%添加“2.2”項下齊墩果酸對照品(即分別添加濃度為0.211 4 mg/mL的齊墩果酸標準液0.12 mL、0.23 mL和0.35 mL)，與供試品溶液混合后按“2.5”項下方法處理并測定吸光度，計算加標回收率，結果見表4。

加標回收計算公式：

表4 加標回收率結果

從表4可以看出，三萜及甾醇的平均加標回收率為101.99%，RSD為1.44%<2%，加標回收率符合規定，表明此方法準確度良好。

3 樣品含量測定

取三批產品試樣，每批產品平行取兩份樣品。精密稱取樣品約1 g，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.5樣品測定”方法測定吸光度值并按照“2.5樣品測定”中公式計算三萜及甾醇的含量，結果見表5。

表5 樣品中三萜及甾醇含量檢測結果

從表5可以看出，三批次產品試樣每一批次產品的三萜及甾醇含量均在2.4 g/100 g左右，且批次內的RSD值均<2%，表明此方法準確、穩定、可靠。

4 結果與意義

本研究結果表明，紫外-可見分光光度法測定靈芝菌絲中三萜及甾醇含量，在0～0.169 12 mg范圍內線性關系良好，精密度RSD為0.73%。樣品溶液在配制后1 h 內穩定性較好，平均加標回收率為101.99%，RSD為1.44%。此方法適用于測定靈芝菌絲體中三萜及甾醇含量。

靈芝菌絲體含有與靈芝相同的三萜及甾醇，具有廣泛的生理活性和良好的應用前景，且通過發酵生產，產量大，周期短，常年可行，這使其很可能成為靈芝類產品開發的又一重點[9-10，17]。盡管目前色譜法和紫外-可見分光光度法均廣泛用于靈芝三萜及甾醇含量測定，但色譜法未收載于《中國藥典》和國家農業農村部頒布的相關標準[8，12-16，18]。因此，在制定靈芝菌絲類產品統一的質量標準時，應優先采用紫外-可見分光光度法測定其三萜及甾醇含量。