三種商用有機(jī)肥中抗生素的污染特征及農(nóng)用生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

周海倫，操家順，3，羅景陽，3，孫藝雯

(1.河海大學(xué) 淺水湖泊綜合治理與資源開發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210098；2.河海大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098；3.國河環(huán)境研究院(南京)有限公司，江蘇 南京 211599)

隨著中國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，預(yù)計(jì)2030 年畜禽糞便產(chǎn)量將達(dá)到37.43億t。將畜禽糞便進(jìn)行肥料化利用既可以解決畜禽糞便污染，又可以回收N、P、K資源[1]，但糞肥的施用也會(huì)導(dǎo)致殘存的抗生素進(jìn)入土壤[2-3]，對(duì)土壤生態(tài)造成危害。已有研究主要探討?zhàn)B殖場(chǎng)周邊[4]、糞肥施用后的土壤中抗生素含量[5]，但有機(jī)肥中抗生素殘留情況研究較少。

本文參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品中獸藥最大殘留量》(GB 31650—2019)標(biāo)準(zhǔn)，選取了30種在動(dòng)物體內(nèi)殘留量較高的抗生素進(jìn)行檢測(cè)。

以湖北省某畜禽糞污處理中心為例，檢測(cè)了厭氧發(fā)酵、好氧堆肥、干化炭化工藝制備的三種商用有機(jī)肥料，分析其抗生素污染特征，并進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為后續(xù)的還田利用提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

30種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品(包括4種四環(huán)素類(TCs)：Doxycycline(DOC)，Tetracycline(TC)，Oxytetracycline(OTC)，Chlortetracycline(CTC)；5種大環(huán)內(nèi)酯類(MLs)：Lincomycin(LIN)，Roxithromycin(RTM)，Azithromycin(AZI)，Erythromycin(ETM)，Tylosin tartrate(TYL)；8種磺胺類(SAs)：Trimethoprim(TMP)，Sulfamonomethoxine(SMM)，Sulfamethoxaz(SMT)，Sulfaquinoxaline(SQX)，Sulfamethazine(SMZ)，Sulfacetamide(STM)，Sulfadimethoxine(SMX)，Sulfadiazine(SDZ)；7種氟喹諾酮類(FQs)：Ofloxacin(OFC)，Norfloxacin(NFC)，Ciprofloxacin(CIP)，Difloxacin(INN)；4種抗真菌類(β-lactams)：Miconazole(MCZ)，N4-Acetyl-Sulfamethoxazole(NAST)，Ketoconazole(KTC)，F(xiàn)luconazole(FLE)；2種氯霉素類(CAPs)：Thiamphenicol(TAP)，Sulfathiazole(ST))均購于中國阿拉丁公司；甲酸、乙腈、氫氧化銨均為色譜純；甲醇、檸檬酸、丙酮、NaH2PO4、Na2EDTA、NaOH均為分析純。

ACQUITY UPLC Xevo TQ型高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(配備ACQUITY BEH C18色譜柱)；AUTOTRACE 280型固相萃取儀(配備HLB固相萃取柱)；MZY-UCR10V型超純水儀；SX2-4-10Z型烘干機(jī)；XZ-16T型臺(tái)式離心機(jī)；ALPHA1-2LD PLUS型凍干機(jī)；SCILOGEX MX-S型旋渦混勻器；SCQ-6201C型超聲波清洗機(jī)等。

1.2 樣品采集

樣品采自湖北省某畜禽糞便資源化處理中心，所處理糞污覆蓋7個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)共計(jì) 102萬頭生豬、500萬羽家禽、6萬頭牛，總計(jì)年產(chǎn)150萬t。資源化處理中心的畜禽糞污全量化利用制備有機(jī)肥的方式為好氧處理、干化炭化、厭氧發(fā)酵三種，可分別制備有機(jī)肥、炭基肥、液肥三種商用有機(jī)肥料。樣品按固態(tài)和液態(tài)分類采集，每個(gè)取樣點(diǎn)重復(fù)取樣3次，每次取樣200 mL，混合后，分為2份平行樣本，共計(jì)36個(gè)樣品(24個(gè)固態(tài)樣品，12個(gè)液態(tài)樣品)，所有樣品取樣后-4 ℃保存[6-7]。

圖1 畜禽糞污處理流程和取樣點(diǎn)Fig.1 Treatment processes of livestock manureand sampling points

1.3 分析方法

1.3.1 樣品處理 固體樣品經(jīng)凍干機(jī)冷凍干燥，研磨后過40目篩網(wǎng)。分別稱取1 g糞便樣品，用 10 mL 檸檬酸酸化、乙腈提取，在漩渦混勻器上 2 500 r/min 混勻10 s，25 ℃超聲15 min，然后在 4 ℃，4 500 r/min條件下離心15 min，重復(fù)提取 1次，收集上清液，通過聚四氟乙烯過濾膜，氮?dú)獯到桑?00 mL超純水稀釋，通過0.7 μm玻璃纖維過濾膜，待進(jìn)入固相萃取儀。液體樣品離心后(9 000 r/min，3 min)取上清液5 mL，用甲酸/乙腈初始流動(dòng)相稀釋200～500倍，過0.22 μm親水性玻璃纖維膜后保留濾液，無需萃取，置于-4 ℃避光保存，以待上機(jī)。

1.3.2 色譜條件和質(zhì)譜條件 所有樣品均采用電噴霧正離子(ESI+)和電噴霧負(fù)離子模式(ESI-)下操作的Water LC-MS/MS進(jìn)行分析。每個(gè)樣品進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相為氫氧化銨(溶劑A)和乙腈(溶劑B)，流速為200 μL/min。濃度梯度(時(shí)間(min)，A%和B%曲線)的程序如下：(0，90/10)，(0.25，90/10)，(3，10/90)，(4，10/90)，(4.01，90/10)和(5，90/10)。其他色譜和質(zhì)譜參數(shù)參考已有文獻(xiàn)[8-9]，毛細(xì)管電壓保持在3 000 V。

1.3.3 回收率實(shí)驗(yàn) 在1 g干燥的空白樣品中，分別添加5 μg/L的四環(huán)素類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20，100，400 μL，對(duì)應(yīng)的添加濃度分別為0.1，0.5，2 mg/kg，混勻穩(wěn)定10 min后，后續(xù)步驟與預(yù)處理步驟相同，上機(jī)測(cè)定[10]。每個(gè)加標(biāo)濃度水平各平行3次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)加標(biāo)樣品中目標(biāo)抗生素的回收率為65.4%～105.9%，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.997。

1.4 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

1.4.1 生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法 風(fēng)險(xiǎn)商值法(RQ)是環(huán)境中污染物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的主要方法之一，已被廣泛用于評(píng)估土壤環(huán)境中抗生素潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的大小。抗生素的RQ值由下式計(jì)算：

RQ=MEC/PNEC

(1)

式中，MEC為土壤中預(yù)測(cè)的抗生素濃度；PNEC為抗生素抗性選擇的預(yù)測(cè)無影響濃度，根據(jù)RQ值可以分為3個(gè)污染等級(jí)：0.01≤RQ<0.1，為低風(fēng)險(xiǎn)；0.1≤RQ<1，為中風(fēng)險(xiǎn)；RQ≥1，為高風(fēng)險(xiǎn)[11]。抗生素的毒理性數(shù)據(jù)可直接在美國環(huán)保署EPA ECTOX數(shù)據(jù)庫中查找，土壤的毒理性數(shù)據(jù)缺失時(shí)使用淡水中數(shù)據(jù)和水-土壤分配系數(shù)進(jìn)行折算[12-13]。計(jì)算方法如下：

PNECwater=EC50/AF

(2)

PNECsoil=PNECwater×Kdsoil

(3)

式中PNECwater——淡水中抗生素抗性選擇的無效應(yīng)濃度，μg/L；

PNECsoil——土壤中抗生素抗性選擇的無效應(yīng)濃度，μg/kg；

Kdsoil——土壤-水的分配系數(shù)，L/kg，為了最大化估計(jì)土壤中抗生素的影響，選擇現(xiàn)有研究中土壤類型相近的最低PNECsoil進(jìn)行估計(jì)[14]；

EC50——急性毒性參考因子，半最大效應(yīng)濃度，mg/L；

AF——評(píng)估因子，考慮到目標(biāo)抗生素毒性數(shù)據(jù)都具有短期試驗(yàn)，故AF取值1 000[15]。

1.4.2 抗生素濃度計(jì)算方法 糞便中的抗生素向土壤遷移的過程十分復(fù)雜[16]，故本研究在已知三種有機(jī)肥料抗生素濃度的基礎(chǔ)上，按照歐盟公布的評(píng)估獸藥環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的新指南(VM)適當(dāng)調(diào)整后，對(duì)有機(jī)肥施用后的土壤中抗生素濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)。首先按作物生長(zhǎng)需求量計(jì)算可施用于土地的最大肥量[17]，其次檢測(cè)出有機(jī)肥中抗生素濃度，再計(jì)算施用有機(jī)肥后犁過的土壤中抗生素濃度[18]。為了以最壞情況計(jì)算，預(yù)測(cè)濃度不考慮隨氣候變化、農(nóng)業(yè)活動(dòng)導(dǎo)致的部分抗生素降解或遷移，將犁過土壤中抗生素濃度作為MEC值代入式(1)進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)商值的計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 畜禽糞便初始抗生素殘留情況

6大類30種抗生素的檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 樣品中抗生素檢出率及濃度均值Table 1 Detection types and average concentrations of antibiotics in samples

由表1可知，采集的樣本中，6大類抗生素均有效檢出。在未經(jīng)處理的糞污中共檢出抗生素19種，檢出種類以四環(huán)素類TCs、喹諾酮類FQs、大環(huán)內(nèi)酯類MLs及磺胺類SAs為主，四大類抗生素ΣTCs、ΣFQs、ΣMLs、ΣSAs濃度均值分別為 1 472.91，28.62，1.87，3.3 μg/kg(干基)，與胡獻(xiàn)剛等檢測(cè)的豬糞中各類抗生素相比四環(huán)素類的平均濃度偏高[8]，土霉素最高值達(dá)3 626.9 μg/kg(干基)。檢出濃度最高的4種畜禽糞便中的抗生素分別為土霉素、金霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素，皆屬四環(huán)素類(濃度≥450 μg/kg(干基))。

4種四環(huán)素類抗生素強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素在12份固態(tài)樣品中檢出率皆為100%，喹諾酮類抗生素檢出種類最多，共檢出7種，按檢出率高低，分別為氧氟沙星=諾氟沙星=恩諾沙星>洛美沙星>氟羅沙星>環(huán)丙沙星>雙氟沙星。檢出率越高，代表該抗生素在糞便處理過程中的持久性越強(qiáng)，越不易降解。

大環(huán)內(nèi)酯類有效檢出林可霉素、羅紅霉素和阿奇霉素3種，抗真菌類和氯霉素類各有效檢出一種分別為咪康唑和甲砜霉素，以上三類抗生素中濃度最高的僅為3.3 μg/kg(干基)，可見不同種類的抗生素殘留濃度之間存在著超過3個(gè)數(shù)量級(jí)的差距，可能原因：一是抗生素在動(dòng)物體內(nèi)的代謝程度不同而導(dǎo)致排出體外的抗生素殘余量差異較大；二是在畜禽養(yǎng)殖過程中不同抗生素的使用量會(huì)根據(jù)生長(zhǎng)周期、季節(jié)的變化而有所波動(dòng)。

2.2 固態(tài)有機(jī)肥抗生素殘留情況

固態(tài)糞便資源化方式分為好氧堆肥處理和干化炭化處理，分別制備有機(jī)肥(CP)和炭基肥(CBOF)，各工藝階段抗生素殘留情況見圖2。

圖2 四類主要檢出抗生素在好氧堆肥和干化炭化過程中的濃度變化Fig.2 Concentration changes of major detected antibioticsduring composting and carbonizationa.四環(huán)素類(TCs)；b.喹諾酮類(FQs)；c.大環(huán)內(nèi)酯類(MLs)；d.磺胺類(SAs)

由圖2可知，有機(jī)固態(tài)肥料制備過程中各類抗生素總量呈波動(dòng)式下降趨勢(shì)，脫水及固液分離環(huán)節(jié)對(duì)固態(tài)畜禽糞便中的TCs去除率為21.6%～57.4%，對(duì)FQs去除率達(dá)94.0%～96.4%。經(jīng)過預(yù)處理后，固態(tài)糞污分為堆肥和炭化兩種處理方式，分別制備CP和CBOF。為調(diào)節(jié)水分含量，畜禽糞便在堆肥和炭化前與木屑等物料進(jìn)行混合。除MLs外，所有抗生素濃度都因水分的極速變化而迅速降低30%～68%。

堆肥處理后，抗生素種類由19種減至8種，四類主要抗生素ΣTCs、ΣFQs、ΣMLs、ΣSAs濃度平均值分別為47.28，2.73，6.25，0.38 μg/kg(干基)，OTC濃度依然最高，為285.15 μg/kg(干基)。除了SMM和TMP去除率不足90%，其余抗生素去除率普遍達(dá)95%。堆肥處理對(duì)四環(huán)素類和喹諾酮類抗生素的去除效果較好，去除率為90%～95%，因?yàn)門Cs和FQs對(duì)生物降解十分敏感。但MLs和SAs經(jīng)過預(yù)處理后濃度升高，這是由于固液分離后的糞污總量大大減少，導(dǎo)致抗生素在固相中的富集。堆肥中的MLs和SAs在處理前后出現(xiàn)的負(fù)去除情況可能是由于處理周期較長(zhǎng)，進(jìn)料與出料非同一批次糞污，原料抗生素濃度本就有差異，故檢測(cè)結(jié)果作為糞污和有機(jī)肥中殘留的抗生素定性研究有較高參考價(jià)值，若作為定量研究需要進(jìn)一步取樣測(cè)試。

干化炭化對(duì)喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類抗生素幾乎100%去除，殘留的抗生素濃度總殘留量小于1 mg/kg，但對(duì)四環(huán)素類抗生素去除率僅為72%～88%。與堆肥處理相比，干化炭化對(duì)抗生素的總?cè)コ矢?0%～30%，主要原因是絕大部分抗生素都有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和羰基、羥基和氨基等活潑基團(tuán)，不具備熱穩(wěn)定性。堆肥溫度最高在70～80 ℃，而炭化爐中溫度為400 ℃，持續(xù)高溫加熱使抗生素的分子結(jié)構(gòu)或基團(tuán)更易被破壞。

2.3 液態(tài)有機(jī)肥抗生素殘留情況

由圖3可知，液肥(LOF)處理過程中，厭氧池對(duì)四環(huán)素、土霉素的去除效果較好，但對(duì)林可霉素、磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星的去除率皆低于15%，對(duì)金霉素出現(xiàn)了負(fù)去除的情況；而初沉池對(duì)各類抗生素的去除效果不佳，多數(shù)出現(xiàn)了負(fù)去除，原因可能是液肥在沉淀池中最長(zhǎng)停留30 d，有一定的濃度富集情況。

圖3 液肥處理過程中主要抗生素濃度Fig.3 Concentration changes of major detected antibioticsduring the liquid organic fertilizer

液態(tài)畜禽糞便處理前檢測(cè)出的初始抗生素為8種，不足糞便原料抗生素種類的1/2，與固態(tài)畜禽糞便相比TCs未檢出強(qiáng)力霉素，F(xiàn)Qs未檢出氟羅沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星；MLs未檢出羅紅霉素、阿奇霉素；SAs未檢測(cè)出磺胺二甲基嘧啶和甲氧芐啶。雖然這些抗生素都具有水解穩(wěn)定性，但對(duì)固態(tài)糞便表現(xiàn)出更強(qiáng)的吸附親和力，故在液態(tài)糞便中未能達(dá)到檢出限。處理后的液肥中仍包含3中抗生素殘留，殘留濃度最高的依然是金霉素和林可霉素，濃度分別為341.86，147.12 mg/L，占液肥殘留抗生素總量的98%。金霉素和林可霉素在豬的保育、育成育肥、哺乳、妊娠階段的呼吸道、軟組織感染的預(yù)防和治療都有大量使用；特別是林可霉素使用量在中國獸用藥中排名第三，除此之外這兩種抗生素在鹽溶液中的溶解性強(qiáng)且不易發(fā)生水解，在水中具有持久性，是液肥后續(xù)處理中需要關(guān)注的主要目標(biāo)。

2.4 三種有機(jī)肥處理過程中抗生素殘留情況的比較

三種有機(jī)肥處理過程中抗生素殘留濃度和去除率見表2。

表2 三種有機(jī)肥中抗生素的殘留濃度和去除率Table 2 Residue concentration and removal rate of antibiotics in three kinds of org-fertilizer

由表2可知，三種有機(jī)肥中每一種高殘留抗生素都是四環(huán)素類，尤其是OTC，這也是糞便樣品中檢測(cè)到的最高濃度，顯示了畜禽飼養(yǎng)過程中四環(huán)素類的使用范圍廣、用量大。除OTC的殘留水平高于其他研究外[19]，TC和CTC的殘留水平與其他研究中大致相同。

在本研究中，堆肥、炭化和厭氧處理對(duì)抗生素有不同的去除機(jī)理，三種處理的平均去除率分別為 86.85%，96.35%和61.38%，抗生素殘留濃度為畜禽糞便(1.87～1 472.91 μg/kg干重)>LOF(147.12～341.86 mg/L)>CP(0.38～47.27 μg/kg干重)>CBOF(0.05～1.41 μg/kg干重)。由此可知：①TCs是堆肥、炭基肥和液肥的主要?dú)埩艨股兀虎赥Cs、FQs和SAs更容易留在固相中，脫水處理是去除糞便固體部分TCs和FQs的決定性因素；③高濃度殘留代表該類抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中的使用較多，且處理過程不易降解。

2.5 有機(jī)肥料農(nóng)用的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

以農(nóng)業(yè)部公布的《畜禽糞污土地承載力測(cè)算技術(shù)指南》中關(guān)于區(qū)域植物養(yǎng)分需求量和豬當(dāng)量糞肥養(yǎng)分供給量作為參考依據(jù)，在美國環(huán)保署EPA ECTOX數(shù)據(jù)庫中查找相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)(表3)，并計(jì)算得出三種有機(jī)肥殘留濃度的風(fēng)險(xiǎn)熵值見圖4。

由圖4可知，炭基肥和堆肥中所有抗生素的風(fēng)險(xiǎn)可接受，熵值<0.1；液肥中金霉素具有中風(fēng)險(xiǎn)，其次林可霉素風(fēng)險(xiǎn)較高，達(dá)0.04，液態(tài)肥料的安全性低于固態(tài)肥料，其農(nóng)用的潛在風(fēng)險(xiǎn)更大。然而，就有機(jī)肥施用的特點(diǎn)來看，此處的結(jié)果為肥料施用后到達(dá)淺層土壤的即時(shí)濃度，濃度水平為mg/kg級(jí)。隨著時(shí)間的遷移和降雨影響，土壤中抗生素濃度會(huì)進(jìn)一步下降，生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)也隨之降低。除此之外，抗生素對(duì)植物、土壤動(dòng)物與微生物的毒理效應(yīng)還受土壤的理化性質(zhì)等影響[20]。雖然有機(jī)肥中的抗生素向土壤環(huán)境中遷移量有限[21]，但考慮到抗生素的降解周期長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物同樣具有毒性的特點(diǎn)，長(zhǎng)時(shí)間的有機(jī)肥施用仍需要慎重考慮。

表3 檢出抗生素急性毒性數(shù)據(jù)及土壤分配系數(shù)Table 3 Acute toxicity data and soil distribution coefficient of antibiotics detected

圖4 三種有機(jī)肥中抗生素生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)熵值

3 結(jié)論

在好氧堆肥、干化炭化、厭氧發(fā)酵三種方式制備的有機(jī)肥、炭基材料、液肥中，抗生素殘留含量最高的分別為土霉素285.15 μg/kg(干基)、環(huán)丙沙星 2.38 μg/kg(干基)、金霉素341.86 mg/L，就去除率而言，炭化處理>好氧堆肥>厭氧發(fā)酵。

急性毒理學(xué)數(shù)據(jù)表明，三種有機(jī)肥料中抗生素對(duì)土壤環(huán)境的危害：液肥>堆肥>炭基肥，這與三種肥料制備工藝對(duì)抗生素去除效果一致，故抗生素殘留濃度與其對(duì)應(yīng)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)具有正相關(guān)性。抗生素在土壤中的毒理性數(shù)據(jù)仍有較多的缺失，毒性數(shù)據(jù)多來源于水生植物或動(dòng)物，對(duì)各類農(nóng)作物種子及幼苗的毒性仍不明晰，需要進(jìn)一步探究。