乳酸發酵提升飼料中水溶性鈣的研究

熊曉莉，熊嶼吾，林輝，李寧

(1.重慶工商大學 環境與資源學院，重慶 400067；2.重慶工商大學 環境與資源化學技術國家級實驗教學示范中心，重慶 400067)

發酵飼料具有改善魚蝦腸道功能[1-2]及免疫力[3-4]、調理水質[5]、提升誘食效果[6]等作用。乳酸菌常用于飼料發酵，其發酵工藝條件簡單，并被世界公認為最為安全的發酵方式[7-9]。本文將含黃粉蟲糞的飼料原料中添加貝殼粉，用乳酸混合菌發酵，將貝殼粉中不溶性無機鈣轉化為有利于生物吸收的可溶性鈣。采用兩段式發酵工藝，以飼料中可溶性鈣含量為指標，在單因素實驗基礎上進行正交實驗，對發酵體系的配方進行優化，為制備具有高可溶性鈣含量的蝦飼料提供方法。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

混合乳酸桿菌(100億cfu/g)，由菌長生物提供；黃粉蟲蟲糞(由餐廚垃圾、麥麩、青菜等經黃粉蟲過腹轉化制得，45目)；豆粕、貝殼粉(100目)、全麥粉均為飼料級；紅糖，食品級；黃粉蟲蟲粉，實驗室自制；去離子水。

ICAP-7200 ICP-OES等離子體光譜儀；JY2002型電子分析天平；WKF130萬能粉碎機；PHS-3C精密酸度計；TG16-WS高速離心機；SHZ-82恒溫水浴搖床。

1.2 實驗方法

1.2.1 飼料原料的準備 取黃粉蟲糞50份，豆粉20份，黃粉蟲幼蟲粉10份，全麥粉20份，充分混合均勻，得到飼料原料I。

1.2.2 一段式發酵 將貝殼粉、紅糖顆粒、發酵菌劑(糞腸球菌、植物乳酸桿菌按質量比1∶1比例混合，下同)、100份的飼料原料I、去離子水適量，依次加入發酵瓶中，充分拌勻后，密封，將發酵瓶放入恒溫培養箱中，溫度控制在35 ℃，每3 h搖晃1次發酵瓶，持續96 h。將發酵好的物料烘干，測其水溶性鈣含量。

1.2.3 兩段式發酵[10]

1.2.3.1 第一階段：液態發酵 與一段式發酵相同量的貝殼粉、紅糖顆粒、發酵菌劑、去離子水，依次加入發酵瓶中，密封后，充分搖勻后，將發酵瓶放入恒溫培養箱中，溫度控制在35 ℃，每3 h搖晃1次發酵瓶，持續48 h。

1.2.3.2 第二階段：固態發酵 將液態發酵得到的發酵液與100份的飼料原料I混合均勻，并密封，在35 ℃，厭氧發酵48 h。將發酵好的物料烘干，得發酵飼料，測其水溶性鈣含量。若需制成顆粒，也可在發酵過程中加入黏合劑。

1.3 分析方法

1.3.1 水溶性鈣含量的測定 取1 g烘干的樣品放入50 mL離心管內，加入40 mL去離子水，將離心管固定在水浴搖床上。設置溫度70 ℃，振蕩速度250 r/min，振蕩60 min。離心，取上清液，用 ICP-OES等離子體光譜儀測定[11]。

1.3.2 總鈣測定 取1 g烘干的樣品放入坩堝中，將坩堝放在110 ℃加熱板上，使得飼料炭化至無煙。將坩堝放入馬弗爐中，在550 ℃加熱3 h。燒制后的粉末用10 mL硝酸溶解，并定容至100 mL，過濾，用ICP-OES等離子體光譜儀測定[12]。

2 結果與討論

2.1 一段式與兩段式發酵效果對比

一段式與兩段式發酵效果對比見圖1。

由圖1可知，隨著發酵體系中水的添加量增加，水溶性鈣含量不同程度地增加。在兩段式的發酵過程中，當水用量小于100 g時，水溶性鈣含量增加趨勢明顯；當水用量高于100 g時，水溶性鈣含量增加趨勢平緩。而在一段式發酵中，隨著物料含水率的增加，水溶性鈣含量持續增加，從曲線趨勢可預測，若物料的含水率足夠高，水溶性鈣含量會與兩段式接近，但物料含水率過高，不利于后期物料的烘干和造粒。因此，在相同情況下，兩段式發酵的效果要優于一段式發酵。故本文僅以兩段式發酵進行研究。

圖1 一段式發酵和兩段式發酵效果Fig.1 Comparison between one-stage fermentationand two-stage fermentation

2.2 單因素實驗

2.2.1 貝殼粉添加量對水可溶性鈣的影響 去離子水80 g，紅糖6 g，發酵菌劑6 g，發酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃ 液態發酵和固態發酵各48 h，考察貝殼粉添加量對飼料中可溶性鈣含量的影響，結果見圖2。

圖2 貝殼粉添加量對可溶性鈣產量的影響Fig.2 Effect of shell powder addition onsoluble calcium yield

由圖2可知，當貝殼粉的添加量≤5 g時，飼料中水溶性鈣的產量迅速增加，這是因為貝殼粉中的碳酸鈣與體系中過量的乳酸發生化學反應，故增加貝殼粉的量，可以提高水溶性乳酸鈣的生成量。但當貝殼粉的量增加到一定程度后，大量消耗體系中的乳酸，導致發酵體系中乳酸含量過低，不利于碳酸鈣轉化為乳酸鈣。因此，貝殼粉的添加量宜為5 g。

2.2.2 水添加量對水可溶性鈣的影響 貝殼粉 3 g，紅糖6 g，發酵菌劑6 g，發酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃ 液態發酵和固態發酵各48 h，考察水的添加量對飼料中水溶性鈣含量的影響，結果見圖3。

圖3 水用量對可溶性鈣產量的影響Fig.3 Effect of water content on soluble calcium yield

由圖3可知，當水的添加量≤100 g時，飼料中水溶性鈣的產量迅速增加。這是因為適當的含水量有利于發酵體系充分混合，發酵產生的乳酸與貝殼粉充分接觸，使得反應速度增快。當水的添加量 >100 g 時，含水量對生成水溶性鈣的影響不明顯。

2.2.3 紅糖添加量對水可溶性鈣的影響 水80 g，貝殼粉3 g，發酵菌劑6 g，發酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃液態發酵和固態發酵各48 h，考察紅糖添加量對飼料中水溶性鈣含量的影響，結果見圖4。

圖4 紅糖添加量對水溶性鈣產量的影響Fig.4 Effect of brown sugar addition onsoluble calcium yield

由圖4可知，當紅糖的添加量≤4 g時，隨著紅糖添加量的增加，乳酸鈣的產量隨之增加。這是因為糖分為菌的生長提供營養，乳酸菌通過代謝將糖分轉化為乳酸。但當糖分的添加量>4 g時，乳酸鈣的產量隨之降低。可能是因為當發酵體系中糖分濃度超過了乳酸菌生長所需要的最佳濃度時，過高濃度的糖分對乳酸菌具有抑制作用，從而降低了乳酸鈣的產量，乳酸發酵其他物料的過程中，也觀察到近似的現象[13]。因此，紅糖的添加量選擇為4 g。

2.2.4 發酵菌劑添加量對水可溶性鈣的影響 水80 g，貝殼粉3 g，紅糖6 g，發酵原料Ⅰ 100 g，35 ℃液態發酵和固態發酵各48 h，考察發酵菌劑添加量對飼料中可溶性鈣含量的影響，結果見圖5。

由圖5可知，當發酵菌劑的添加量≤6 g時，隨著發酵菌劑添加量的增加，乳酸鈣的產量隨之增加，成品飼料水溶性鈣含量也隨之增加。這是因為當發酵菌劑添加量過低時，乳酸菌難以形成優勢菌種，乳酸菌與其他雜菌相互競爭，導致反應體系中乳酸菌的數量無法快速增加，降低了乳酸的產量。隨著發酵菌劑的增加，使得乳酸菌形成了優勢菌種，乳酸菌在短時間內快速大量地繁殖，產生了大量乳酸，大量乳酸的存在使得反應體系的pH值快速降低，過低的pH值會抑制乳酸菌生長[14]，同時也對其他雜菌的生長繁殖起抑制作用[15]。當發酵菌劑的添加量>6 g時，乳酸鈣的產量基本上不隨發酵菌劑的添加量而變化，這是因為發酵體系中營養物質的含量是固定的，只能維持一定數量的乳菌正常生長，當體系中乳酸菌含量達到上限時，乳酸鈣的產量也隨之達到了上限。

圖5 發酵菌劑添加量對水溶性鈣產量的影響Fig.5 Effect of fermentation bacteria addition onsoluble calcium yield

2.3 正交實驗

采用正交實驗法確定兩段式發酵的最佳效果，以水溶性鈣為指標。液態發酵條件：發酵溫度 35 ℃，發酵時間48 h。采用L16(44)正交實驗，對液態發酵階段的貝殼粉添加量、去離子水添加量、紅糖添加量和發酵菌劑添加量進行優化，實驗因素及水平見表1。液態發酵階段結束后，將發酵液與發酵原料Ⅰ 100 g充分混合，進入固態發酵階段，發酵條件：發酵溫度35 ℃、發酵時間48 h。將發酵完成的物料烘干，得發酵飼料，測發酵飼料中的水溶性鈣含量。正交實驗結果見表2。

表1 L16(44)正交因素水平表Table 1 L16(44) Orthogonal factor and level table

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，兩段式發酵過程，影響飼料中水溶性鈣的主次因素是D>A>C>B，液態發酵階段的最佳配方為：發酵菌劑6 g(D3)、貝殼粉5 g(A4)、紅糖5 g(C3)、去離子水140 g(B4)。但因B因素為本實驗的最不敏感因素，且B4和B2的k值差別很小，為了飼料成品干燥水分時能量消耗低，故最終選擇B2作為該實驗的最優條件。在D3A4C3B2的配方組合下進行驗證實驗，得到發酵產物中水可溶性鈣的平均含量為16.08 mg/g(干基)。

2.4 發酵前后飼料中鈣含量的對比

對飼料原料Ⅰ、飼料原料Ⅱ、發酵飼料Ⅰ、發酵飼料Ⅱ、商品飼料中水溶性鈣和總鈣的測定結果見表3。

表3 飼料中鈣含量的對比Table 3 Comparison of calcium content in feed

由表3可知，單純地向飼料原料中添加貝殼粉而不進行發酵處理，只能增加飼料中總鈣的含量，不會提升飼料中水溶性鈣的含量，并不利于蝦對鈣的吸收，補鈣效果不佳。而某商品中總鈣含量雖高，但鈣的存在形式也主要以不利于蝦吸收的無機鈣為主。發酵飼料Ⅱ中的水溶性鈣含量為16.08 mg/g，達總鈣含量的55.28%，可知通過本實驗的發酵過程，大大提升了飼料中水可溶性鈣的含量，更有利于蝦對鈣的吸收利用。

3 結論

采用兩段式發酵工藝，對添加有貝殼粉的飼料進行發酵。研究表明，菌接種量、糖、水和貝殼粉的添加量，對發酵后的飼料中的水溶性鈣含量均有影響。正交實驗得到了液態發酵階段的最優配方：菌接種量6 g，貝殼粉5 g，紅糖5 g和水100 g，在溫度35 ℃下發酵48 h后，然后將發酵液與100 g飼料原料混合，再次在35 ℃下發酵48 h，可得到水可溶性鈣含量為16.08 mg/g(干基)的飼料，大大提升了飼料中有利于魚蝦生長的水溶性鈣的含量，為生產魚蝦水溶性高鈣飼料開辟新途徑。