微生物腐蝕研究中代謝組學方法的應用進展

付強，許萍

(北京建筑大學 水環境國家級實驗教學示范中心 城市雨水系統與水環境省部共建教育部重點實驗室，北京 100044)

腐蝕經常造成嚴重的經濟損失，在2014年，我國的腐蝕成本約為21 278.2 億元人民幣，約占當年國內生產總值的 3.34%[1]。在石油和天然氣工業、冷卻水系統、污水管道系統、飲用水系統和海洋工業中都經常出現微生物腐蝕的現象。其中微生物腐蝕涉及到微生物、腐蝕金屬和周圍環境等多個方面[2]，因此，需要研究微生物腐蝕所涉及的三個方面[3]，才能理解微生物腐蝕背后的機制并制定有效防腐蝕對策[4]，目前環境因素和腐蝕金屬方面的研究已經相對充分[5-6]，但是關于腐蝕點位的微生物群落形成機制和導致微生物腐蝕發生的分子的信息尚少。

目前對微生物腐蝕中微生物群落的研究已經從對微生物計數的宏觀測定發展到對微生物群落中存在的DNA的分子分析，再發展到大規模測序以確定微生物群落微生物種類[7]。表征微生物腐蝕中的微生物群落組成已被證明是有助于研究群落中不同生物體的具體功能的[8]。通過基于代謝組學的技術探索微生物腐蝕，可以進一步了解腐蝕中微生物種群的多樣性及其代謝機理。

1 代謝組學研究流程與應用方法

簡單來說，代謝組就是細胞在代謝過程中產生的所有低分子量(<1 500 Da)代謝物的整體集合，是生物合成/分解代謝途徑的中間體或產物，并提供細胞活動和生理狀態的直接功能讀數[9]。而代謝組學就是針對生物代謝組進行的全面研究，其重點在于通過分析確定生物體內各種代謝物質的形成、分配過程和時空動態變化規律，結合統計生物學的大數據分析與計算機模型，在機理上探明生物代謝網絡的調節規律，以達到定量預測基因變化與環境條件改變而導致的生物代謝網絡的變化。代謝組學研究的典型工作流程見圖1。

圖1 組學研究流程圖Fig.1 Flow chart of metabolomics research

1.1 樣品采集與制備

微生物代謝組學的樣品制備步驟包括快速取樣、淬滅以及代謝物的提取[10]。樣品制備是為了盡可能地去除樣本中的雜質，同時盡可能的保留樣品中的所需的目標代謝產物的完整性。而所需的樣品提取和預處理方法會根據研究對象、目的和采用的分析技術不同而不同[11]。

細胞新陳代謝的變化速率極快，因此，樣品必須快速淬滅以終止代謝反應，并且不引起代謝物的任何化學變化或從細胞內泄漏代謝物。理想的淬滅過程可以完美地將細胞凍結，完全停止所有酶的活動，以獲取其“代謝快照”，但是這在處理微生物樣品時是一項極其困難的任務[12]。液氮淬滅、酸堿淬滅和低溫甲醇淬滅等是常用的細胞淬滅方法，低溫甲醇淬滅是目前微生物代謝組學中常用方法。

在代謝物的提取過程中應去除較大的“污染”分子，如DNA、蛋白質，最后去除提取過程中使用的溶劑。代謝物提取通常包括添加有機溶劑、裂解細胞、分離代謝物、蒸發溶劑，最后留下干燥樣品并冷凍儲存以待使用。之后再根據不同的檢測技術對樣品進行相應的預處理方式。

1.2 代謝產物分析與檢測

由于代謝產物的組分和數量不同，且代謝產物的官能團、揮發性、極性等存在差異，使用單一分析平臺往往不能全面地進行代謝組學分析，而且各種分析平臺都有其適用范圍和優缺點，因此現在廣泛使用多種分析平臺組合的方法。表1比較了幾種代謝組學常用的分析平臺的特點和優缺點[13]。

表1 代謝組學常用的分析平臺比較Table 1 Comparison of analysis platforms commonly used in metabolomics

在代謝組學研究技術中核磁共振(NMR)是應用最早、最為常見的技術之一。目前常用的有氫譜、碳譜和磷譜，其中以氫譜應用得最為廣泛[14]。NMR 技術對樣品的需求量相對較少、幾乎不需要進行前處理，能快速準確地對樣品進行高通量分析，且具有高重現性和無損傷性，能夠提供一定條件下生物組織或體液的完整代謝產物信息[15]，能用于活體和原位研究[16]。

質譜(MS) 是通過測定質荷比和氣相離子的豐度鑒定樣品中存在的化學成分的含量和類型。MS儀器一般由樣品導入系統、離子源、質量分析器、檢測器、數據處理系統等部分組成。其中，離子源使樣品中各組分發生電離，生成不同荷質比的帶電荷的離子，經加速電場的作用形成離子束[17]。質量分析器位于離子源和檢測器之間，是質譜儀的核心組成部件，在質量分析器中利用電場和磁場將氣相離子在空間或時間上按照質荷比的大小進行分離。常見的質量分析器有：飛行時間質量分析器、四極桿質量分析器、四極桿離子阱和離子回旋共振質量分析器等[18]。四級桿分析器體積小、重量輕、掃描速度快，常與其他質譜連接，是目前最成熟、應用最廣泛的一種質量分析器，但它的質量范圍和分辨率有限[19]。

1.3 數據處理及分析

首先對原始代謝數據需要進行預處理，使其轉化成可直接用于數據統計學分析的形式。預處理之后再進行PCA和偏最小二乘法判別分析等多元統計分析和生物信息學分析，識別出生物標志物、推斷代謝途徑等[20]。表2給出了一些微生物代謝組學數據庫，有助于識別生物標志物。

表2 微生物代謝組學數據庫Table 2 Microbial metabolomics database

1.4 典型應用方法

在實驗室環境中應用代謝組學研究微生物腐蝕時，典型的實驗方法是，將金屬試樣浸泡在引起微生物腐蝕的微生物培養物中或是采集的發生微生物腐蝕的現場水中[21]，該實驗方法將有助于確定培養物或現場水在腐蝕金屬時發生的具體反應。首先要考慮的是是否要對代謝物進行有針對性的量化或者是代謝物的廣泛無偏差的分析。而且應在實驗開始時測定培養物或現場水中的代謝物，以生成現有化合物的基線輪廓，該基線輪廓再與微生物腐蝕發生后的化合物輪廓進行對比，從而確定出發生變化的化合物。并使用化學成分相同但微生物已滅活的現場水或不含微生物的無菌培養基作為對照組，以區分出微生物群落因非生物腐蝕而產生的代謝物。

在分析實驗過程中采集樣品時應與基線輪廓和對照組進行比較，以確定其代謝物水平與微生物群落相關。例如，在實際樣品中檢測到代謝物但未出現在基線中，這表明代謝物是由于腐蝕而產生的，而與對照組的比較可以確認化合物的來源是生物的或是非生物的。類似的方法可用于分析在基線中存在但在實驗過程中增加或減少的化合物。

另一個重要的實驗設計考慮因素是將縱向分析(即可用于在不同時間點取樣的平行實驗)納入微生物腐蝕研究中，以便識別對微生物腐蝕的發生和維持起關鍵作用的代謝物，但這尚未納入微生物腐蝕代謝組學分析的實驗設計中，但此類分析方法已用于識別其他應用中的生物標志物[22]。

2 代謝組學在微生物腐蝕研究中的應用進展

微生物腐蝕的一個特點是差異性巨大，微生物的群落組成在不同環境之間是不同的，甚至是在兩個相近腐蝕位點之間也是不同的[23]。雖然宏基因組學已成功用于識別腐蝕中的不同微生物及其相對豐度[24]，但不可能直接將微生物的相對豐度與微生物腐蝕中的致腐蝕作用聯系起來。例如，雖然SRB廣泛存在于腐蝕環境中，并扮演著重要的角色，但它們并不總是群落中最豐富的致腐蝕的微生物。研究顯示，在美國發生微生物腐蝕現象的天然氣輸送管道中，SRB僅占微生物種群的1%左右，而反硝化菌占4%，產甲烷菌則占13%[25]。即使是在不同的腐蝕環境中，不同組成的微生物群落仍表現出相對相似的微生物腐蝕水平，僅僅靠識別腐蝕環境中存在的微生物不可能全面了解該系統中發生的微生物腐蝕。理解微生物群落及其與金屬表面相互作用不能僅僅是基于群落中存在的微生物，還應基于群落中微生物的代謝功能。

2.1 在微生物腐蝕研究中的應用

代謝組學方法可分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學，靶向代謝組學用于研究一小部分代謝物的變化，這些代謝物是根據先驗知識預先選擇的。由于這些代謝物是已知的，因此通常可以用純標準品來生成標準曲線并量化不同樣品中代謝物的濃度[26]。

在微生物腐蝕的背景下，靶向代謝組學可用于量化已知與微生物腐蝕相關的微生物群落的代謝物水平，例如乙酸和丙酸。如果有來自同一微生物群落的多個時間點的樣本，也可以確定這些假定的生物標志物代謝物水平的縱向或時間變化，以深入了解微生物群落中發生的代謝反應和腐蝕過程。在一項研究中，Beale等[27]直接使用從農村供水管網中獲得的水進行代謝組學分析，確定了管道生物膜所表達的細胞外代謝物。隨即又擴展了這項工作，成功地得到了一些水樣的細胞外代謝組概況，確定了關鍵的代謝組生物標志物。在后續的研究中，通過從發生腐蝕微生物腐蝕的管道生物膜中提取分離微生物，分別在不暴露于銅和暴露于低水平的銅下進行了分析。根據它們的活性和銅暴露情況進行區分，研究發現，兩組試驗中的微生物的代謝活動會根據微生物代謝銅的能力而變化。這證明了代謝組學方法對于區分由類似的微生物組成，但是經歷了不同的物理化學活動(如腐蝕和抑制腐蝕)的水網生物膜的類別的可行性。Guo等[28]運用精準靶向代謝組學和遺傳學整合策略，從代謝的角度解讀大腸桿菌生物膜的形成機制，在大腸桿菌生物膜體系當中精準發現和驗證若干具有調控生物膜形成的功能代謝產物，并初步闡明鐵載體生物合成介導的鐵離子調控功能代謝物表達，進而影響生物膜形成的代謝機理。研究首次確定了5種能有效調節生物膜形成的功能代謝物(L-色氨酸、L-亮氨酸、亞精胺、50-MTA 和CMP)，初步探明了深層次的腐蝕機理，研究了基于功能代謝產物生物合成調控解離微生物生物膜形成的轉化應用。在后續的研究中發現錳可以通過調節表型形態和代謝重編程來抑制生物膜的形成，發現了16種不同的功能代謝物和相關的三種代謝途徑，包括糖酵解、TCA循環和色氨酸代謝，這些代謝途徑在生物膜形成過程中主要被錳改變[29]。

與靶向代謝組學相比，非靶向代謝組學可用于確定樣本中存在的多種代謝物的相對豐度[30]。非靶向代謝組學用于微生物腐蝕時，可以確定與微生物腐蝕相關的微生物群落中存在的不同代謝物的水平。Brauer等[31]研究了1018碳鋼表面海洋細菌生物膜的化學組成與生物膜下鋼的腐蝕損傷之間的相關性，首次成功地對腐蝕金屬材料上的海洋生物膜進行了環境化學和代謝組學成像。通過研究發現，一些特定的代謝物與碳鋼基底中腐蝕的發生和程度密切相關，而其他的則不相關。基于上述結果，他們認為生物膜代謝組與腐蝕程度和性質之間的空間相關性可以作為微生物腐蝕研究的一個有用指標。通過對不同微生物腐蝕地點的微生物群落進行非靶向代謝組學分析，有助于識別不同地點的微生物代謝，同時可以幫助識別與微生物腐蝕位置相關的關鍵代謝產物。例如，Bonifay等[32]將琥珀酸確定為挪威地區腐蝕管道特有的代謝產物。

2.2 在微生物腐蝕早期預測中取得的成果

特定代謝物的存在與否以及相關微生物群落組成與腐蝕之間的關系，可以理解為類似于胃腸道中某些微生物和微生物代謝物的存在與否被用來推斷人體疾病的原因和后果[33]。如果在受微生物腐蝕影響的位置檢測到特定代謝物，則可能表明該位置微生物群落中發生了與代謝物形成或消耗相關的代謝反應，就可以推斷在這個系統中發生了微生物腐蝕。如果在多個受微生物腐蝕影響的位置檢測到相同的代謝產物，這可能表明導致該代謝物產生的代謝反應在微生物腐蝕機制中具有重要作用。這項信息再與群落組成信息相結合，可以識別在不同位置對微生物腐蝕都有貢獻的微生物。因此，對微生物群落的代謝物足跡進行分類研究，對于研究微生物腐蝕中的腐蝕機制具有重要的意義，在一定程度上可以預測微生物腐蝕的發生。

代謝組學通過分析微生物因其代謝活性而消耗或排泄的代謝物來推斷生物膜活性，具有監測城市水網生物膜中微生物活性的潛力。Beale等[34]對發生藍綠水現象的管道的水進行分析，用熒光光譜法快速、簡便地監測配水網絡和建筑管網中是否存在細胞外代謝物，用GC-MS進一步研究和鑒定相關的細胞外代謝物。以此可以確定生物膜的狀態或類型，從而確定微生物腐蝕的特征，將來隨著特定代謝物與不同微生物的相關性研究的增加將進一步增強該工具的實用性。

根據群落中存在的生物的代謝反應產物描述微生物群落的功能是建立在這樣一個假設之上的，即微生物群落是基于群落不同成員之間的代謝反應相互作用而形成和維持的[35]。在這個模型中，假設一種微生物產生的分子被另一種微生物利用，不同微生物之間的這種合作是群落形成和維持的基礎。由于不同的微生物都具有一系列執行相同生化和酶促反應的代謝機制，因此群落可能具有不同的組成，但仍在進行一組相似的反應。事實上，最近的幾項微生物腐蝕研究指出微生物群落產生的分子足跡或代謝物是微生物腐蝕發生和維持的關鍵因素。表3是從發生微生物腐蝕的銅管道生物膜中確定的代謝物特征，這些研究發現，暴露于銅和未暴露于銅的微生物之間的代謝物主要區別在于氨基酸的存在，以及羧酸的消耗和表達，而這些有機酸在腐蝕中起著重要的作用。為了可以更全面了解管道生物膜的影響，需要研究各種管道生物膜在不同混合菌種和暴露條件下的代謝組，這可能需要大量的試驗工作，并形成大量數據的集合，才有助于形成更完整的管道微生物群代謝組，代謝物表達與管道生物膜內微生物之間的關系就可以通過代謝物鑒定來推斷。

表3 從發生微生物腐蝕的銅管道生物膜中確定的代謝物特征Table 3 Characteristics of metabolites determined from biofilm of copper pipeline with microbial corrosion

另外，Bonifay等[32]也在微生物腐蝕研究中經常觀察到羧酸。例如，乙酸和酯、丙酸和琥珀酸是最常見的羧酸，其他羧酸如草酸和馬來酸也被認為是關鍵的微生物腐蝕相關代謝物，除了羧酸外還發現了氨基酸和脂肪酸。盡管不常見，但在微生物腐蝕研究中，脂肪醇(如十六醇[27])以及糖磷脂[31]也都有很高的豐度，因此也被認為是關鍵的微生物腐蝕相關代謝物。除了所有這些類別的化合物外，還發現了與碳水化合物代謝相關的幾種化合物與微生物腐蝕有關。

上述研究為利用代謝組學研究微生物腐蝕提供了堅實的基礎。具體而言，這些研究表明，氨基酸、羧酸、脂肪酸和脂肪醇可能是用于代謝組學分析微生物腐蝕的理想候選物。至于是否可以作為微生物腐蝕研究的生物標志物，還需要進行更詳細深入的研究。

2.3 在腐蝕機理研究方面取得的成果

代謝組學的應用有助于代謝產物酸腐蝕理論的研究，將微生物群落和代謝產物信息與檢測微生物的位置所特有的腐蝕機理知識結合起來，可以全面研究微生物群落與金屬表面之間的相互作用。比如基于硫酸鹽還原細菌(SRB)等微生物是否直接使用金屬進行新陳代謝，或諸如產酸細菌等微生物是否通過產生腐蝕性代謝物導致腐蝕。細胞外電子轉移微生物腐蝕和代謝物微生物腐蝕被認為是可能的微生物腐蝕機制[39]。

除了群落結構外，鑒定群落產生的代謝物可以使我們更全面地了解微生物腐蝕中復雜的微生物和電化學之間的相互作用[30]。已經證明，生物膜的形成是在相對較短的時間內通過由微生物分泌的胞外聚合物(EPS)而形成的[40]。Keevil 等[41]將生物膜描述為一種復雜的結構，其由包裹在EPS中的小菌落排列組成，但在這些小菌落堆疊之間具有顯著的通道，便于擴散。它們是大量水合的凝膠狀薄膜，會對腐蝕過程產生物理影響[42]，如果在表面上不均勻分布，會導致在金屬基底上建立永久的陽極和陰極區域。然而，生物膜對環境具有高度反應性，生物膜的存活需要營養轉移到內部，因此，該膜不能發揮完全屏障的作用。這種開放結構意味著生物膜也可以含有氧化的腐蝕產物，甚至還可以包含特定的區域，在該區域中某些化學物質的擴散受到限制。例如，一組微生物的活動可能會阻礙或促進其他微生物的發展，SRB和鐵還原細菌(IRB)之間可能存在競爭，因此IRB可能會降低SRB的活性。相比之下，產酸細菌除了本身具有腐蝕性之外，還可以提供有益于SRB生長的營養和環境條件。而生物膜和微生物對腐蝕的主要影響是通過改變陽極或陰極反應的速度來實現的。

如果陽極或陰極過程的反應物和/或產物不能自由進出金屬表面，腐蝕速率可能是擴散受限或濃度受限的。Videla等[42]研究了微生物的呼吸過程如何改變金屬界面的氧濃度，如果生物膜覆蓋整個表面，這可能導致陰極反應速率的降低和腐蝕的減少，或者，如果涂層是不完整的，可能會產生促進局部腐蝕的電位梯度。Edyvean等[43]闡述了后一種情況，即生物膜通過形成與飲用水管道中的結節相關的氧氣電池來加速腐蝕。除了氧梯度，化合物和pH梯度也可以在生物膜內產生，并可以驅動腐蝕過程。此外，酸性代謝物的產生可以通過溶解保護膜和提供氧化劑(即質子)來增加陰極過程[43]，顯著降低局部pH值。Terry等[44]指出pH值的差異可能高達9個單位。硫氧化細菌可以在pH<2的情況下產生硫酸。利用氮的細菌、真菌和微藻也能產酸，這種局部酸區可以溶解任何保護膜，加速腐蝕進行。Duncan等[45]直接在管道表面沉積物中檢測固著的生物和代謝物，發現了嗜熱產氫產甲烷菌、同養細菌、硫代硫酸鹽還原細菌和SRB。這些微生物可以通過產生有機酸、CO2、硫物質以及通過氫氧化和鐵還原來促進金屬腐蝕。

2.4 在微生物腐蝕研究方面的發展趨勢

將代謝組學納入微生物腐蝕研究的最后一步，也是極其重要的一步，是將代謝數據與微生物群落組成信息相結合。這不僅可以驗證觀察到的結果，還可以幫助識別參與代謝反應的微生物群落成員。而且，當兩者結合時，這些技術的局限性可以得到改善。正如Noecker等[46]使用16SrRNA測序分析微生物的群落，利用PICRUSt軟件預測群落的基因組含量。然后，預測的基因含量信息可用KEGG等數據庫中相關的反應信息來推斷群落的代謝潛力。這種方法既考慮了特定群體成員代謝物的產生，也考慮了其他群體成員代謝物的消耗，并預測了宏基因組中不同基因對代謝物水平增加或減少的相對貢獻。預測的代謝產物表達可以與實際代謝組學數據建立聯系，并且這種聯系用于識別有助于群落產生特定代謝物的關鍵微生物。

盡管代謝組學在識別微生物腐蝕中的生物標志物和關鍵微生物方面具有很高的潛力，但要將其從研究工具轉變為行業中的標準實踐，仍然需要克服一些技術限制。從方法學的角度來看，由于微生物產生的代謝物性質的多樣性，單一分析方法無法檢測和識別樣本中的所有代謝物[47]。因此，可能需要使用多種方法來增加代謝組覆蓋率。為了使非揮發性化合物與GC-MS兼容，或者為了提高LC-MS的穩定性和與液相色譜柱的結合，通常需要化學衍生。然而，化學衍生已被證明會導致意外副產物的形成，從而導致對化合物濃度的誤判。由于代謝物會快速降解，而且不同樣品之間代謝產物組成的顯著差異可能僅僅來自樣品處理，因此在對現場樣品進行代謝組學分析之前，使用正確的儲存條件和樣品保存技術也很重要。限制代謝組學應用于微生物腐蝕的另一個相關因素是，在樣品采集和制備過程中，代謝物的空間分布信息會丟失。最后，用于識別代謝物的數據庫包含關于化合物的信息通常不夠完整，較少的信息量可能會限制識別代謝物的能力。

多種微生物或優勢微生物往往共同影響著腐蝕的行為，微生物腐蝕研究中要高度關注微生物之間的相互作用，盡可能貼近真實的微生物腐蝕環境。然而，該領域的研究仍面臨著巨大挑戰。一方面是無法在實驗室中再現微生物所處的復雜環境，缺少對微生物腐蝕的原位研究。另一方面，實驗室中是基于可培養技術構建的生物膜系統，簡化了研究，忽略了不可培養微生物在多物種生物膜中的作用。未來的研究應更加關注自然環境中的復雜微生物群落，雖然大多數MS方法不能用于獲得代謝物空間定位信息，但新興的MS技術，如成像質譜(IMS)可用于微生物生物膜中代謝物空間組織的原位分析，腐蝕中各微生物之間相互作用機理研究還需要一個從量變到質變的過程，將來隨著研究的不斷增多和深入，可以通過大量實驗數據總結出多種微生物腐蝕的作用機理。

3 總結與展望

綜上所述，代謝組學已廣泛地用于微生物腐蝕的研究，為微生物腐蝕研究提供了全面系統的分析手段。在過去30年內得到迅速發展并滲透到多項領域，在科學研究與應用方面具有巨大潛力。

在研究微生物腐蝕方面代謝組學方法比其他分子方法更有優勢，因為代謝組學數據提供了微生物群落中發生的生化反應的最終產物的信息，并且更適于早期檢測微生物腐蝕的生物標志物。聯系微生物群落組成和功能的數據來解釋微生物腐蝕機制也很重要，因此，有必要將微生物群落信息與腐蝕機制知識相結合，以便全面研究微生物群落和金屬表面之間的相互作用。

未來可以涵蓋生物體系中多種更廣闊的代謝產物的分析方法將成為研究的重點。同時，為了能有效地從龐大的數據中獲取有用的信息，需要將生物信息學技術與代謝物組學更加緊密地結合，而分析統計學、代謝物組分析、數據處理分析及可視化軟件的發展能更好幫助我們了解環境及基因變化對于微生物代謝網絡和微生物腐蝕的影響。