ctDNA在轉移性去勢抵抗性前列腺癌mCRPC中的治療意義及研究進展

康正，張軼庠，袁也晴

(暨南大學第二臨床學院，廣東 深圳 518000）

0 引言

前列腺癌（PCa）是男性泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內，其發病率在男性所有惡性腫瘤中位居第二位，僅次于肺癌[1]。而在我國，根據2015年全國腫瘤登記地區資料顯示，前列腺癌位列男性惡性腫瘤發病率第6位，占男性惡性腫瘤發病構成的3.35%；位列男性惡性腫瘤死亡率第10位，占男性惡性腫瘤死亡構成的2.1%[2]。近幾年，我國前列腺癌發病率呈顯著上升趨勢[3-4]，且在初診時多數已屬中晚期。轉移性前列腺癌（metastatic prostate cancer，mPCa）是嚴重影響前列腺癌患者預后的重要疾病階段。在歐美人群中，mPCa僅占新發前列腺癌的5%-6%[5-6]，而在我國，這一比例高達54%[7]。持續雄激素剝奪療法（androgen-deprivation therapy，ADT）是轉移性前列腺癌最主要的治療方式，也是各種新型聯合治療方案的基礎，但經過中位時間18-24個月的內分泌治療后，但幾乎所有患者經治療后都會進展為轉移性去勢抵抗性前列腺癌（metastaticcastration-resistantprostatecancer，mCRPC）。mCRPC是指前列腺癌患者經過初始ADT治療后，血清睪酮達到去勢水平（＜50ng/dl或＜1.7nmoL/L），但是疾病進展并出現轉移的前列腺癌階段，疾病進展可表現為PSA水平持續升高（PSA進展）或影像學可見的腫瘤進展（影像進展）。盡管去勢后的睪酮水平很低，但病情仍在發展，預后極差[8-9]。晚期前列腺癌治療方法有很多新進展，但轉移性前列腺癌患者的5年存活率估計為30%，這種高死亡率很大程度上歸因于轉移性去勢抵抗性前列腺癌[10]。mCRPC發病有多種復雜機制參與，對ADT治療敏感性、組織病理類型及基因型存在異質性，也就決定無法用單一的方法進行治療。因此，有必要根據mCRPC形成的分子機制及病理特征進行分型，然后根據各自的特點，采用針對性的個體化治療[5]。而循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）作為一種非侵入式且易于操作的檢測方式，可在mCRPC患者治療過程中進行DNA層面分析，對于探索耐藥機制及疾病進展、預后監測等方面發揮越來越重要的作用[11]。

1 ctDNA檢測

1.1 ctDNA定義及檢測方法

循環游離DNA(cfDNA)是指循環血液中的核酸類物質，包括循環血液中細胞內的核酸、游離的內源性脫氧核糖核酸和外源性DNA和RNA等，細胞凋亡和壞死過程是cfDNA主要來源。cfDNA的增加并不是惡性腫瘤所特有的，其他生理和病理過程也導致cfDNA水平升高，如懷孕、運動、炎癥、糖尿病、膿毒癥和心肌梗死等。cfDNA的血漿水平在正常人個體之間差異很大，但通常低于10ng／mL，在腫瘤患者血漿中cfDNA的濃度通常較高，其中mCRPC患者平均為19 ng/mL[12]。在腫瘤患者的血漿中，cfDNA的主要成分是腫瘤細胞釋放的循環腫瘤DNA(ctDNA)，其中影響ctDNA濃度的因素較多，包括腫瘤轉移體積，轉移部位和腫瘤進展，以及不同腫瘤位置和腫瘤微環境等。此外，ctDNA的半衰期相對較短，從幾分鐘到幾個小時不等[13]，短半衰期使ctDNA優于臨床上通常用于監測腫瘤進展的基于蛋白質的生物標志物，例如血清前列腺特異性抗原(PSA)。其在臨床中常用于前列腺癌療效監測，但是其具有更長的半衰期，并且需要數周才能經歷代表腫瘤動力學的變化[8]。另外，據Shaya Justin[14]等研究，在ctDNA檢測時，檢測到的病原性改變的數量與較低的總體存活率密切相關，而改變的數量與前列腺特異性抗原（PSA）的相關性較弱。這些數據表明，ctDNA在預測mCRPC的預后方面獨立于PSA，也可以作為一種新的判斷mCRPC預后和療效的生物標志物。值得一提的是，穿刺組織標本是前列腺癌相關生物標志物檢測的金標準，但是由于其存在穿刺活檢陽性率、穿刺樣本異質性及穿刺相關并發癥等問題，限制了穿刺組織在mCRPC中的檢測應用。而液體活檢是以循環腫瘤細胞（circulating tumor cells,CTCs）、ctDNA和外泌體為研究對象，通過無創性抽樣方法獲取腫瘤細胞信息的檢查技術 ，通過液體活檢技術對ctDNA檢測可明確腫瘤在發展過程中基因突變、拷貝數變異、染色體重排和甲基化等基因改變[47]。與組織穿刺相比較， 液體活檢樣本的提取方便快捷、風險小、儲存運輸成本低，患者接受度高，此外ctDNA分析能夠客觀地反映所有癌癥轉移中的突變，甚至比標準組織活檢檢查到更多的突變基因，對于癌癥的早期診斷和癌癥治療過程中的療效評估具有重要意義。由于ctDNA的質量和數量變化大，因此需要高特異性和高度靈敏的檢測方法，目前常用的方法包括聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)、磁珠乳液擴增BEAMing(bead,emulsion,amp lification and magnetic)、高通量測序（ next generation sequencing, NGS )、 ARMS、液滴數字PCR ( ddPCR)等。

1.2 液體活檢與組織活檢一致性比較

在mCRPC患者中，骨骼通常是轉移擴散的唯一部位，從前列腺癌的骨骼中獲取腫瘤組織的成功率從25%到75%不等，類似于ctDNA分數與總體腫瘤負荷指標呈正相關[15-19]。據lexander W. Wyatt等[8]多項研究，在mCRPC驅動基因AR、BRCA2、ATM、PTEN、PIK3CA、PIK3CB、PIK3R1、TP53中，觀察到可評估液體和固體活檢之間單個基因拷貝數調用的一致性為88.9%；ctDNA與固體組織活檢在基因組重排也有較好的一致性，雖然大多數重排都落在內含子內，并且不能通過外顯子集中測序方法檢測到，約47.4%在配對的實體活檢中顯示了基因重排的證據。此外，2018年不列顛-哥倫比亞大學的Martin Gleave教授等在《J Natl Cancer Inst》發表了相關的研究，從體細胞突變/拷貝數變異/結構變異三個方面，比較了兩者的一致性：在體細胞突變及拷貝數方面，兩者具有很好的一致性；在體細胞結構變異方面，兩者的一致性較為一般。ctDNA和轉移組織活檢在mCRPC中的顯著一致性表明ctDNA測定可以較好的用于對患者進行分子分層以用于預后和預測目的。值得一提，前列腺癌患者行組織穿刺活檢過程中，由于活檢條件受限如腫瘤轉移部位活檢難度高、轉移灶小以及患者依從性等情況，穿刺結果也存在較大的誤差。而據Shaya Justin等[8]研究，在相應的實體活組織檢查中未檢測到液體活組織檢查中檢測到的109個體細胞突變中的36個（33.0%），其中29例是由于實體活檢覆蓋率不足，但7例突變在實體活檢中顯示統計學缺乏證據（P＜0.01，Fisher精確檢驗）。相比較而言，液體活檢有可能捕獲單個轉移部位的組織活檢可能遺漏或低估的腫瘤基因突變異質性。

2 ctDNA在mCRPC患者中的應用

2.1 ctDNA在mCRPC患者中檢測現狀

對于中樞神經系統腫瘤患者，腦脊液中的基因分子譜可能比血流中的更準確[20]。同樣，對于mCRPC患者，除了血清和血漿之外的其他生物體液也被研究者認為前列腺癌診斷和治療生物標志物的潛在來源，如尿液和精液[21-22]。由于直接接觸前列腺組織和原發性腫瘤，對尿液及精液進行cfDNA和ctDNA分析的優點是可以從直接接觸腫瘤源頭的體液中收集靶向信息[23]。據相關研究表明，與其他惡性腫瘤患者相比，前列腺癌患者血液中的ctDNA水平明顯高于健康人[24-27]。此外，在一項對患有良性前列腺增生(BPH)的前列腺癌患者的研究中，ctDNA水平據報道明顯高于對照組[28]。2015年，癌癥基因組圖譜研究網絡報告了333例原發性前列腺癌的研究結果，結果發現19%的原發性腫瘤存在DNA修復基因突變，包括3%的同源重組修復(HRR)基因BRCA2[29]。150例轉移活檢的外顯子組測序發現，23%的轉移性前列腺癌攜帶DNA修復關鍵基因的改變，同樣涉及同源重組修復基因(BRCA2、ATM和BRCA1)以及錯配修復基因(MLH1和MSH2)[30]。這些基因的改變包括堿基對替換、缺失、插入、拷貝數變異(CNV)和選擇性重排[31]。而據Sonpavde等研究，mCRPC患者ctDNA含量及可檢測性高，大多數（94%）出現了一次以上的ctDNA改變（alterations），最常見的復發性體細胞突變是發生于TP53（36%的患者）；AR（22%）；APC（10%）；NF1（9%）；EGFR（6%）；CTNNB1（6%）；ARID1A(6%)；BRCA1（5%），BRCA2（5%），PIK3CA（5%）。最常見的拷貝數增加的基因是AR（30%），MYC（20%）和BRAF（18%）基因。此外，大量的ctDNA改變與較短的治療失敗時間（TTF）相關（HR：1.05；P=0.026）；AR改變趨向于較短的治療失敗時間（TTF）（HR,1.42；P=0.053)和較短的無進展生存期(PFS)（HR,2.51；P=0.09）[32]。

2.2 ctDNA在mCRPC患者中的耐藥機制研究

雄激素受體（AR）屬于核受體超家族中的類固醇受體，作為細胞內轉錄因子，在前列腺細胞中高表達[33]。它的主要配體是睪酮和5-二氫睪酮，它們的結合決定了胞漿內受體的激活，包括同質二聚化、自磷酸化和移位到細胞核[34]。AR通過確保細胞存活、增殖、遷移和侵襲，在mCRPC的發展中起著重要作用[35]。據Matti Annala等[36]研究，約53%的前列腺癌患者在治療后體細胞群體基因發生了變化，特別是在治療反應強烈之后。與治療相關的變化集中在AR基因上，AR拷貝數平均增加50%，AR突變頻率發生變化，攜帶AR配體結合域縮短重排的患者比例增加2.5倍。研究結論顯示在mCRPC患者AR抑制和驅動獲得性耐藥的序列過程中，顯性AR基因型繼續進化。而Sidaway P等[37]研究顯示，在mCRPC患者中，在活檢樣本中檢測到AR突變的比例相似（10%-20%），在ctDNA中有AR拷貝數增加和擴增、多個AR突變、RB1丟失、MET增加和MYC增加的患者比沒有這些基因組特征的患者對苯扎魯胺耐藥的風險更高[38]。 某項前瞻性研究提到，抗雄激素治療期間出現的一些AR突變與比卡魯胺或阿比特龍-潑尼松治療耐藥相關，并且已知對其他治療敏感，這些畸變的識別有助于指導治療；此外， 血液活檢中發現雄激素受體剪接變異體（androgen receptor-va-riant，AR-V7）檢查陽性的患者對阿比特龍及恩扎魯胺的治療效果不佳，但是不影響多西他賽的療效[39]；Quigley等[40-41]研究對兩名含有BRCA2突變的患者進行了ctDNA完整外顯子靶向測序，顯示產生BRCA2基因逆轉突變的前列腺癌患者對聚腺苷二磷酸荷塘聚合酶（PARP）抑制劑產生耐藥性。

2.3 ctDNA指導mCRPC個性化藥物治療

在ASCO 2021上提出的逐個基因的探索性分析顯示，對于BRCA基因突變的患者，奧拉帕利布和苯扎魯胺或阿比特龍的客觀緩解率（ORR）分別為43.9%和0%，中位總生存期（OS）分別為20.1和14.4個月。關于其他被分析的基因，單一奧拉帕利治療也導致CDK12改變的患者的ORR更高(5.9%比0%)，但ATM改變的患者ORR不高(10.0%比10.0%)，在ATM或CDK12改變的患者中無進展生存期（PFS）或總生存期（OS）差異無統計學意義[42]，而在其他DDR基因如PALB2、FANCA、BRIP1和RAD51B中已證實有反應[43]。據Hussain M等[44]研究，其中發現奧拉帕利布可顯著改善BRCA 1/2或ATM mCRPC患者的放射學無進展生存率，在16%的mCRPC隊列中檢測到BRCA 1/2或ATM擾動，使用ctDNA分析可以免除這些患者接受潛在的痛苦的腫瘤活檢程序或接受雄激素受體途徑抑制劑治療的需要。基于上述研究結果，導致FDA在2020年批準了兩種PARP抑制劑，奧拉帕利和魯卡帕里布，用于DNA修復基因改變的mCRPC。此外，GOODdall等[45]在mCRPC患者奧拉帕尼Ⅱ期的臨床試驗中顯示，經過8周的奧拉帕利治療后患者的ctDNA濃度中位數下降了49.6%，同時ctDNA水平的下降伴隨著無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）的改善，同時治療后血液中ctDNA含量的變化和復發有關。此外，mCRPC患者細胞中PD-L1表達增多，并且前列腺腫瘤微環境中的CD8+T細胞高表達PD-1[46-47]，PD-1/PD-L1抑制劑已經證實對于mCRPC患者具有療效，尤其是MCRPC患者基因檢測中存在微衛星不穩定（MSI-H）或錯配修復缺陷（dMMR）的患者具有較高的臨床價值[5]，因此PD-1/PD-L1抑制劑為晚期前列腺癌的免疫治療提供了新手段。另外，HRR基因突變與對PARP抑制劑和鉑療法的敏感性增加有關，血漿中HRR基因突變的檢測與轉移活檢組織分子分析中這些突變的檢測高度相關。因此，能夠識別由于快速出現適應性耐藥而導致早期治療失敗的患者，從而及時更換治療藥物。

2.4 ctDNA對mCRPC患者療效及預后風險評估

國內外針對mCRPC的個體化精準治療仍處臨床研究階段，其重點是探索mCRPC治療方式、準確的評估患者預后及進行疾病進展風險分層[8]。轉移性去勢耐受前列腺癌(mCRPC)的基因組圖譜不同于原發癌，在腫瘤進展過程中是動態的，對ctDNA動態分析使我們能夠更好地了解腫瘤進展的機制。值得注意的是，在轉移性去勢敏感性前列腺癌（metastatic hormone sensitive prostate cancer，mHSPC）狀態下，即使患者經歷了血清PSA水平下降的生化反應，TP53和ATM中也出現了早期的基因組變化。這些早期的基因組變化強調了前列腺癌在睪酮抑制下的基因組可塑性，這些變化也可能在mCRPC中的抑癌基因和DDR基因中發揮關鍵的生物學作用，并可用于監測微小殘留病灶。此外，Alok Mishra[48]等通過與常規測量方法的直接比較，論證了人ctDNA在無創性、非終末期測量人PCa轉移瘤負荷中的應用。結果表明，ctDNA準確地反映了前列腺腫瘤在軟組織和骨骼中對IR的生長和治療反應，支持了在ctDNA在mCRPC轉移瘤模型中明確人類特異性基因序列的日益增長的價值和方便性。

3 ctDNA臨床應用限制

ctDNA在mCRCP有著獨特的臨床價值,但是由于其存在一定技術局限性，在臨床實踐中應用不廣泛。ctDNA相關檢測主要存在以下問題：①我國前列腺癌患者中晚期患者所占比例較高，ctDNA水平很高，ctDNA檢測可用于治療積極病情監測；而對于早期病變和微小殘留病變，由于腫瘤負荷小，不能敏感檢測到微量的DNA變異，盡管測序技術的靈敏度雖然隨著技術的發展而提高，但仍受到足夠量ctDNA可用性的限制[16]。下一代測序(NGS)和數字PCR等高靈敏度和高特異性的技術的出現極大地促進了ctDNA領域的發展，并使檢測低ctDNA組分的基因組改變成為可能；②目前而言，ctDNA檢測僅在少數醫院開展，具有成本高、價格昂貴等缺點，且隨著腫瘤疾病的進展需要進行多次采樣分析，對于患者經濟承受力要求較高；③ctDNA分析的特異性受到DNA質量和測序技術的限制，由于并不是所有的突變或拷貝數變異都具有生物學意義，因此對血漿DNA中基因組畸變的鑒定需要謹慎的解釋，需要一種全面的生物學和臨床方法來驗證新的生物標志物。且由于采用、分析過程中缺乏統一的國際標準及成熟質量評價體系，檢測結果的可靠性受到質疑[16]；④血漿DNA的分析不能捕捉到額外的生物復雜性層面，如RNA表達或可能與臨床相關的蛋白質水平的差異[49]。

4 總結與展望

ctDNA檢測具有方便快捷、可重復取樣、消除腫瘤異質性特點，作為一種新型腫瘤基因檢測的工具，對于mCRPC患者的篩查、指導治療及實時監測具有重要意義。ctDNA檢測可以作為組織活檢的補充方案，其非侵入性等特點使體液活檢比傳統穿刺組織活檢手段更具優勢，甚至一定程度上可以作為腫瘤組織活檢替代方案。現階段，聯合使用ctDNA和原發腫瘤組織是評估分子亞型的理想方法，并為在精確腫瘤學背景下實施靶向治療鋪平道路[13]。雖然目前階段存在檢測難、費用高、標準不統一等問題，但是隨著NGS等技術的快速發展，測序成本的降低，前列腺癌已經進入精準/個體化治療時代，前列腺癌精準診治政策已讓越來越多的患者收益。