綠僵菌對植物的促生防蟲作用研究進展

劉 婷，夏鵬亮，解曉菲，羅心誠，王 怡，胡宗偉，張浩然，張 燚，王玉雪，王香萍，張建民*

(1.長江大學農學院，湖北 荊州 434000；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000)

內生昆蟲病原真菌(Endophytic insect-pathogenic fungi，EIPF)具有多種功能，作為殺蟲劑可穿透害蟲表皮層直接感染和殺死害蟲，部分則可定殖于植物根系為植物提供多種益處，包括促生、提高植物抗逆性以及防治害蟲等作用[1-2]。

目前，昆蟲病原真菌綠僵菌作為殺蟲劑已廣泛用于害蟲的綠色防控，部分綠僵菌可作為植物內生菌，對植物生長和抗逆境等具有積極的影響，這在近年來成為研究熱點。本文主要對植物內生綠僵菌的研究現狀進行分析和闡述。

1 綠僵菌的基本特性

綠僵菌(MetarhiziumSpp.)隸屬于真菌門(Eumycota)子囊菌亞門(Ascomycotina)核菌綱(Pyrenomyceles)球殼菌目(Sphaeriales)麥角菌科(Clavicipitetaceae)。在1879年俄國生物學家Metchnikoff首次從奧地利金龜子上成功分離得到金龜子綠僵菌(M.anisopliae)，并將其應用于防治奧地利金龜子(Anisopliaaustriaca)和甜菜象甲(Cleonuspunativentris)，隨后綠僵菌逐漸成為農業害蟲生物防治的研究熱點[3]。隨著研究的逐步深入，人們陸續認識到綠僵菌是一類種類豐富、分布廣泛的昆蟲病原真菌，可感染和殺死各類節肢動物(包括昆蟲)。同時，大多數綠僵菌還是腐生菌、根際真菌及有益根系內生菌，并具備在不同生命周期轉換的能力[4]。綠僵菌具有5個基本特征：菌落初期呈現出白色，產孢時表現出不同程度的綠色；分生孢子梗單生或者聚集，呈分生孢子梗座；分生孢子以粘液粘成平行排列的柱狀孢子團；分生孢子長形至長橢圓形；可感染寄生昆蟲[5]。綠僵菌生長最適溫度在24～26℃之間，最適pH值在6.9～7.4之間，此外，綠僵菌適合生長在含有機氮源的培養基中。在干燥的情況下，綠僵菌分生孢子可以保存3年以上[6]。迄今為止，已報道的綠僵菌可以在直翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目等8個目42個科200多種昆蟲體內寄生，甚至可在螨類及線蟲等中寄生[7]。以上特點使綠僵菌成為廣泛使用的生物殺蟲劑之一。

2 植物內生綠僵菌的功能及機理

植物內生綠僵菌的主要功能是具有殺蟲作用、促生作用以及提高植物抗病蟲的能力。

2.1 對植物的促生作用

綠僵菌除了殺蟲作用外，一些綠僵菌還具有促進植物生長的作用。已有多個研究表明綠僵菌可以促進植物的生長，尤其是在脅迫條件下。如綠僵菌可顯著增加洋蔥產量，促進番茄果實變大，促進鹽脅迫下豌豆幼苗和缺肥條件下玉米的生長[8-11]。一般情況下，綠僵菌等真菌通過吸收磷和其他營養物質來顯著促進植物生長，此外，還可從腐爛的有機物中捕獲氮素，并有助于氮在土壤中儲存[12]。有研究表明，綠僵菌可通過浸種、種子包衣等方法與植物建立共生關系[13-14]。而綠僵菌和植物共生關系建立與綠僵菌黏附素(MAD2)有關，當分生孢子接觸植物根表面時，MAD2促進分生孢子附著到根表面[15]。但是綠僵菌如何穿透植物表皮，而且植物細胞間的綠僵菌菌絲如何循序漸進的在細胞壁周圍生長上尚不清楚。相關研究表明金龜子綠僵菌的MAD1黏附素與對昆蟲的毒力相關，而MAD2黏附素則能夠使金龜子綠僵菌黏附于植物，這一事實表明金龜子綠僵菌具有特殊的基因來維持其雙功能的生活方式[16]。其他的特異性調控基因則包括一種新型的運輸根際和根定殖所需的根源養分低聚糖轉運體，一種在腐食營養和致病性中扮演重要角色的RNA結合蛋白[17]，一種幫助調節水解酶的轉化酶[18]。此外，綠僵菌能在整個冬季在卷心菜的根部保持較高水平，這種優勢可使作為根內生菌的綠僵菌在植物死亡后為自身營腐生生活提供營養[19]。目前綠僵菌在植物中的內生作用已在棉花、玉米和番茄等植物中進行了大量研究，如廖興剛等研究發現羅伯茨綠僵菌(M.robertsii)(Mr2575，Mr23和Mr1046)、M.anisopliae(Ma808，Ma932和Ma939)、M.brunneum(Mb820，Mb1187和Mb2974)及M.acridum(Mac324)等綠僵菌均能定殖玉米根部，菌株Mb820、Ma939對玉米幼苗葉片發育增效最高達42.8%，Mr23對玉米莖稈生長增效最高達15.7%[20]。Sasan和Bidochka等發現羅伯茨綠僵菌能夠定殖于柳枝稷草和扁豆植株中，并表現出促進根毛的生長作用[21]。此外，近幾年來，金龜子綠僵菌與昆蟲及植物宿主互作關系的相關研究已成為昆蟲病原真菌開發應用研究領域的新方向。目前，已初步探明金龜子綠僵菌能定殖于植物根部[19]，還可利用植物根部分泌的蔗糖和棉籽糖等多糖類碳源物質營腐生生活[18]。

2.2 提升植物的抗蟲性

現有研究表明，許多昆蟲病原真菌可提升植物的抗蟲性。如Quesada-Moraga等從罌粟癭蜂(Iraellaluteipes)幼蟲體內分離出一株球孢白僵菌，并通過種子處理成功定殖于罌粟中，定殖后的植株表現出一定的抗蟲性[22]。此外，孫藝昕等報道4株玉米內生真菌(一株為白僵菌)可影響玉米蚜的生長發育，且具有趨避作用[23]。綠僵菌作為真菌，也具有提升宿主作物抗蟲性的作用。Liao等報道金龜子綠僵菌在與宿主植物共生期間，可殺死取食根部的害蟲并轉移氮素給植株以維系自身的養分來源，或通過分泌植物發育必需的某些生長激素(如IAA)激活植物免疫系統，提高對病蟲害的防御等途徑促進宿主植物的生長[24]。而Ahmad等報道玉米內生菌羅伯茨綠僵菌可促進玉米植株生長，抑制小地老虎(Agrotisipsilon)的發育和改變植物防御基因的表達[25]。綜上所述，一些昆蟲病原真菌綠僵菌在植物上定殖后，可在一定程度上提高植物的抗蟲性。

2.3 直接殺蟲功能

綠僵菌的殺蟲功能及機理研究一直是綠僵菌相關研究的重點。綠僵菌可通過分生孢子對害蟲進行觸殺，且不同于必須通過攝入才能致病的細菌和病毒，綠僵菌通常只需通過穿透昆蟲表皮層就可感染昆蟲。因此，綠僵菌特別適合發展為生物農藥，替代化學殺蟲劑。相關殺蟲機理研究表明，綠僵菌在識別到一種合適的昆蟲寄主后，即可通過形成感染結構(附著胞)和分泌不同的特異性效應子穿透昆蟲表皮層，然后通過產生芽生孢子和器官特異性效應子用于侵染昆蟲的血腔[26]。綠僵菌主要借用表皮層降解酶和機械壓力分解穿透和同化昆蟲的表皮層，同時克服侵染過程中遇到的障礙[27]。綠僵菌一旦到達血腔就會成功獲得營養物質和避免能夠吞噬和包裹入侵微生物的抗菌蛋白和循環細胞(血細胞)而進行繁殖[28]。一旦寄主死亡后綠僵菌就會從內到外破壞角質層產生分生孢子，之后在傳播過程中開始新的感染。

3 綠僵菌與植物根際微生物群相互作用及其與昆蟲-植物的關系

在自然界中綠僵菌會與整個寄主植物根際相關的微生物群相互作用，包括作為促進生長的根際細菌或真菌生防菌等有益微生物[29]。如某些木霉(Trichodermaspp.)種類產生的SM(6-pentyl-alpha-pyrone，peptaibols，harzianum A and aspinolides)可誘發植物防御病害，同時對植物的生長和發育也具有積極的影響[30]。綠僵菌與木霉存在相關性[31]，且有研究表明，它們在對植物的作用中存在共性：M.robertsii綠僵菌和根際生防真菌木霉(T.virens)都能進行蔗糖代謝和控制根系定殖[18]。然而，綠僵菌和木霉在寄主根系定殖的機制存在差異[32]。

同時，有研究表明綠僵菌與植物、昆蟲之間的聯系主要是在營養的基礎之上，它們三者的關系是互惠互利、相互依存的。此外，植物可以昆蟲作為氮的來源[33]，如豬籠草在充滿液體的深腔中誘捕昆蟲后可獲得氮源，昆蟲產生的氮可占植物氮含量的70%[34]。綠僵菌還可以寄生并殺死土壤中的昆蟲，然后將昆蟲產生的氮轉移到植物中供植物生長利用[35]。同樣植物的生長也有益于綠僵菌，植物可通過光合作用為綠僵菌提供碳[36]。這樣綠僵菌從昆蟲體內獲得的氮源越多，宿主植物生長的就越茂盛，從而回饋越多的碳源給綠僵菌，最終形成一種互惠互利的穩定關系：生長旺盛的植物可為綠僵菌提供更大更穩定的棲息地，同時綠僵菌的寄生可以進一步滋養和保護植物。因而通過根施、浸根或澆灌等方法將綠僵菌施用于土壤，不但有利于綠僵菌的生存，而且還可有效防治地下害蟲、促進植物生長，同時對植株上害蟲的防治亦具有良好的效果，可做到“一菌多用”。

4 綠僵菌在害蟲綠色防控中的應用潛力

綠僵菌目前作為殺蟲劑已在世界各地得到廣泛應用。在世界上最成功的生物控制項目之一就是在巴西每年使用金龜子綠僵菌防治200萬hm2的甘蔗田害蟲沫蟬[37]。但是，綠僵菌使用的最大限制是殺蟲效率慢，雖然這有利于綠僵菌從害蟲體內獲取營養。此外，綠僵菌同樣也具有其他微生物農藥無法避免的問題。如Nahar等研究證明綠僵菌在繼代培養幾代后，其ITS序列并沒有任何變化，但是毒力卻出現下降，表明綠僵菌對害蟲毒力的穩定性對于綠僵菌商品化至關重要[38]。綠僵菌在使用時還存在其它一些缺陷，主要表現在：效果較緩慢，作用成分復雜，有害生物控制范圍較窄，易受環境因素的影響，產品有效期短、質量穩定性較差。目前，隨著分子生物技術的快速發展，通過組成性表達綠僵菌毒力基因提高殺蟲活性或者將外源毒素基因導入綠僵菌并獲得超表達，從而克服了這些缺陷并提高了綠僵菌殺蟲效率。如郭冰峰先后進行了多種與綠僵菌毒力相關的基因的克隆和功能分析研究[39]。此外，CRISPR/Cas9基因編輯技術也可以應用于昆蟲病原真菌綠僵菌中[40]。另外，還可以將綠僵菌與其他低毒高效的化學農藥或者一些植物源藥劑混合使用，降低田間環境因素的干擾。如研究表明綠僵菌與多種化學藥劑具有良好的相容性，可與多種化學農藥甚至寄生蜂等協同作用而達到增效的效果[41-42]。

綠僵菌作為重要的生物殺蟲劑之一，在害蟲的綠色防控中占據十分重要的地位。將綠僵菌通過種衣，根施、浸根和澆灌等方式帶入土壤，不僅對地下害蟲具有良好的防控作用，而且可以促進農作物的生長發育，提高農作物的抗病蟲能力。此外，部分內生綠僵菌還表現對某些植物病原微生物具有拮抗作用，比如Ramanpreet等發現羅伯茨綠僵菌對豆科植物病原菌枯萎病菌具有一定的拮抗作用[43]。其次，綠僵菌具有多功能的生活方式，除了寄生昆蟲之外還可以營腐生生活，在適宜的條件下能夠大量的繁殖，持續控制害蟲。此外，土壤的存在對綠僵菌具有一定的保護作用，如可防止紫外線的傷害和溫度的急劇變化[44-45]。總之，植物內生綠僵菌對于農作物的生長發育和害蟲的綠色防控具有極大的挖掘與開發潛力。