開心散對雙側海馬CA1 區注射Aβ1-42 致AD 大鼠的治療作用及機制研究

裴海鸞馬貝貝王婷婷李瑞吉劉金輝于尚玥婁天宇左澤平田時秋李依林王晨曉田穎穎田 驕趙新月劉 闖郭玉東王 晶*王志斌*

(1.北京中醫藥大學中藥學院,北京 102488;2.北京同仁堂研究院,北京 100071;3.北京市藥品檢驗研究院,北京 102200)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種起病隱匿并進行性發展的神經系統退行性疾病,該病多發于65 歲以上的老年人,病者在患病后7～10 年內即不可避免地走向死亡[1-2]。 AD 患者臨床表現為長時間的認知功能衰退、情節記憶與身體機能持續惡化、精神行為和睡眠-覺醒周期混亂,伴隨明顯的語言系統缺陷、情緒波動異常以及嚴重的生活能力喪失。 AD 典型的病理特征為β-淀粉樣蛋白(amyloid beta-protein,Aβ)的積聚與沉積[3]、tau 蛋白過度磷酸化形成的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)[4]、慢性神經炎癥[5]以及顯著的突觸損傷與神經元丟失[6]。 全球現今約有4400 萬人罹患AD,隨著社會人口老齡化的加劇與AD 病癥患者趨于年輕化,預計在2050 年AD病人數量將增至1 億。 疾病的迅速發展在毀壞個人健康與家庭安定的同時,也為社會工作與全球經濟帶來沉重負擔。

開心散記載于唐代藥王孫思邈所著的《備急千金要方·卷十四·小腸腑》中,主治“好忘”,由人參、遠志、石菖蒲及茯苓四味中藥組成。 開心散復方中人參大補元氣,安神益智;遠志祛痰開竅,解郁寧心,二者共用可除邪氣,養心血,散痰涎,利九竅,補臟腑之精虧,使耳目聰明,強志不忘。 茯苓利水滲濕,健脾寧心;石菖蒲開竅豁痰、化濕、醒神益智,兩藥配伍可化血積,治痹痛,定心氣,去痰阻,理五臟經絡之氣亂、濕濁,使精神通透,心腦暢明。 由此全方共奏益氣養心、補虛、化痰、除濕利竅及安神益智之功,這與AD“臟腑虧損,髓海空虛,瘀血、痰濁阻塞經絡腦竅”的病因病機格外契合,因此常被用于臨床治療“善忘”病癥。

近年來,國內學者對開心散靶向癡呆的藥理學研究愈發關注,但多集中于網絡藥理學預測[7]、效應物質發掘[8]及單一信號通路如氧化應激[9]、神經炎癥[10]、腦內神經再生[11]的驗證,關于開心散經典藥理活性的多環節考察仍為罕見。 因此,本研究擬采用雙側海馬CA1 區注射Aβ1-42造模損傷SD 大鼠為研究對象,并參照AD 發生發展的相關學術論點設立檢測因素與靶標,對開心散復方抗癡呆的藥理活性進行較為全面地考證與篩查,以期為經典古方的進一步開發及深層次的通路挖掘提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級體重為(260～300)g 的SD 大鼠,雌雄各半,70 只,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2016-0011],動物飼養在北京市藥品檢驗研究院[SYXK(京)2020-0041],本研究由北京市藥品檢驗所實驗動物倫理委員會審查通過,并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

石杉堿甲片(河南太龍藥業股份有限公司,批號:190304);開心散浸膏粉(由上海綠谷生命園醫藥有限公司提供,批號:190301)。

Aβ1-42(BIOSS, 貨 號: bs-0107P); 二 甲 亞 砜(DMSO) (國藥集團化學試劑有限公司,批號:20180404);甲苯胺藍染液(貨號:G1032)、蘇木精-伊 紅 染 液( 貨 號: G1003)、 GSK-3β ( 貨 號:GB11099)、Tau(貨號:GB11178)、β-actin(貨號:GB12001)及BAX(貨號:GB11690)購自武漢賽維爾生物科技有限公司;BCL-2(Affinity,貨號:BF9103)。乙酰膽堿(ACh)試劑盒(貨號:CEA912Ge)、乙酰膽堿轉移酶(ChAT)試劑盒(貨號:SEB929Ra)、乙酰膽堿酯酶(AChE)試劑盒(貨號:SEB447Ra)、淀粉樣前體蛋白(APP)試劑盒(貨號:SEB020Ra)、Aβ1-40酶聯免疫吸附試劑盒(貨號:CEA864Ra)、Aβ1-42酶聯免疫吸附試劑盒(貨號:CEA946Ra)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(貨號:SEA133Ra)、白介素-6(IL-6)檢測試劑盒(貨號:SEA079Ra)及白介素-1β(IL-1β)檢測試劑盒(貨號:SEA563Ra)均由武漢云克隆科技股份有限公司提供。

Morris 水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所制,型號:DMS-2);腦立體定位儀(北京眾實迪創科技發展有限責任公司,型號:ZS-FD/S);KDS Legato130微量注射泵(美國KD scientific 公司);微型手持式顱鉆(深圳市瑞沃德生命科技有限公司,型號:78001);高速組織研磨儀(Servicebio,型號:KZ-Ⅱ);酶標檢測儀(BioTeK,型號:Epoch)。

1.3 實驗方法

1.3.1 AD 大鼠的模型制備

(1)Aβ1-42寡聚體的孵育

將1 mg 的β-淀粉樣蛋白1-42 片段(Aβ1-42)溶于44 μL 的二甲亞砜(DMSO)中,再緩慢加入PBS溶液(456 μL),邊加邊輕搖混勻,定容到所需濃度(2 μg/μL)。 封口膜封好后,將溶液放入37℃恒溫培養箱中孵育7 d,使其聚集老化。

(2)動物術前篩選

將大鼠適應性喂養7 d 后進行篩選,經Morris水迷宮實驗判別其空間學習記憶能力,淘汰游泳行為過于遲鈍的大鼠,將篩選出的正常大鼠隨機分為3 組:空白組10 只,假手術組10 只,其余歸入造模組。

(3)手術過程

大鼠麻醉后,將其置于腦立體定位儀上進行固定;定位手術區,局部備皮,酒精消毒;剪開大鼠頭部皮膚,切口沿中線分布,長度約15 mm,將顱骨表面粘膜撥開固定,使顱骨充分暴露;參照《大鼠腦立體定位圖譜》[12],確定前囟位點并標記,鉆孔位點定位于前囟后方3.6 mm,旁開2 mm,以1.0 mm 鉆頭鉆孔;注射點定位于大鼠海馬CA1 區,即自鉆孔位垂直顱骨表面向內進針約4.3 mm;恒速垂直注射,雙側各注射Aβ1-42寡聚體5 μL,以1 μL/min 的速度持續注射5 min,注射后留針5 min,再緩慢撤針,以確保溶液充分彌散;操作結束后,用牙科水泥封閉鉆孔,以青霉素粉涂于切口處以防感染,隨后縫合切口,碘伏擦拭消毒;將大鼠置于電熱毯上等候蘇醒,使其平穩度過術后虛弱期。 假手術組大鼠參照上述操作注射等量的生理鹽水。 術后恢復3～7 d。

(4)癡呆大鼠判別

用Morris 水迷宮定位航行實驗測試其逃避潛伏期,以空白組大鼠4 次訓練的平均逃避潛伏期(學習成績)作為參考值(所有空白大鼠學習成績的平均值記為A),并計算出同1 d 內每只造模大鼠的平均逃避潛伏期(記為B),若(B-A)/B>20%則判定造模成功,歸為癡呆大鼠。

1.3.2 分組及給藥

將50 只判定造模成功的癡呆大鼠按逃避潛伏期隨機分為5 組:模型組、石杉堿甲組(0.046 mg/kg)、開心散低劑量組(11.48 mg/kg)、開心散中劑量組(22.96 mg/kg)與開心散高劑量組(45.92 mg/kg),每組10 只。 連續灌胃給藥30 d,每日1 次。 空白組、假手術組與模型組給予等量的純化水。

1.3.3 Morris 水迷宮行為學測試

(1)定位航行試驗

試驗共歷時5 d,每天定于固定時間段,每個時間段訓練4 次。 4 次訓練即將動物分別從4 個不同的起始點(不同象限)放入水中。 動物找到平臺后或120 s 內找不到平臺(潛伏期記為120 s),則由實驗者將其拿上平臺,在平臺上休息15 s,再進行下一次試驗。 每日以動物4 次訓練測得逃避潛伏期的平均值作為動物當日的學習成績。 前2 d 的定位航行試驗作為適應性游泳訓練以熟悉迷宮環境,統計動物在第3、4、5 天的學習成績變化。

(2)空間探索試驗

第6 天撤除原平臺,將動物任選1 個入水點放入水中,所有動物必須為同一入水點,記錄動物在2 min 內跨越原平臺的次數、在目標象限的停留時間、目標象限的游泳路程及游泳總路程,計算得出目標象限游泳路程所占總路程的百分比(目標象限游泳路程/游泳總路程)。

1.3.4 標本采集

Morris 行為學測試結束后,每組隨機選取4 只大鼠,低溫環境下快速斷頭取腦,置于冰磚上矢狀切割腦組織,左側半腦組織用4%的多聚甲醛溶液固定,4℃保存,用于病理染色及免疫組化分析;右側半腦低溫下進行海馬和皮層的分離,并將海馬、皮層分別用錫箔紙包裹,置于凍存管,-80℃保存,備用于Western blot 檢測;剩余的各組大鼠在低溫環境下快速斷頭取腦,以冷生理鹽水清洗去除殘血,濾紙吸干后用錫箔紙包裹,-80℃凍存,以供ELISA檢測。

1.3.5 HE 染色與Nissl 染色

采用HE 染色及Nissl 染色法觀察各組大鼠腦組織的病理形態與損傷狀況,在400 倍成像下查看皮層、海馬組織各區域神經元的數量、結構與排列,并分析尼氏小體的數目與著色深淺,截圖采集圖像。

1.3.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)

樣本處理:準確稱取待測腦組織重量,按重量(g):體積(mL)= 1 ∶9 的比例加入9 倍體積0.9%的生理鹽水,并放入勻漿珠,冰水浴條件機械勻漿,制成10%的腦組織勻漿,低溫(4℃)離心10 min(3500 r/min),分離上清液備檢。

檢測指標:膽堿能神經遞質(ACh、ChAT 及AChE)、炎癥因子(TNF-α、IL-6 及IL-1β)及β-淀粉樣蛋白(APP、Aβ1-40及Aβ1-42)。

1.3.7 免疫組化染色分析(IHC)

采用IHC 法檢測大腦組織中tau 蛋白、GSK-3β的表達水平:在400 倍成像下分別截取海馬及皮層區域內互不重疊的3 個視野,分別測量每張切片中海馬及皮層區域各3 個視野陽性表達的積分光密度(integrated optical density,IOD)值,IOD 值越高,代表陽性表達越強。

1.3.8 蛋白免疫印跡法(Western blot)

使用Western blot 法測定皮層、海馬組織中BAX、BCL-2 的表達程度:分析目標條帶的光密度值,將目的條帶灰度值/內參條帶灰度值的比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法

所有數據均采用SAS 8.2 軟件進行處理,各組數列均呈正態分布時,數據以平均數±標準差(±s)表示,采用ANOVA 進行單因素方差分析,同時用LSD-t檢驗法進行組間的多重比較,P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 開心散對AD 大鼠學習記憶能力的影響

2.1.1 開心散對AD 大鼠逃避潛伏期的影響

定位航行實驗結果顯示,與空白組或假手術組相比,模型組大鼠在第3、4、5 天的逃避潛伏期明顯延長,差異有統計學意義(P<0.05)。 相較于模型組,在第3 天,開心散低、中、高劑量組逃避潛伏期明顯下降(P<0.05 或P<0.01);第4 天,石杉堿甲組、開心散低、中劑量組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05 或P<0.01);第5 天,石杉堿甲組、開心散中劑量組逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)(結果見表1、圖1)。

表1 開心散對AD 大鼠逃避潛伏期的影響(±s)Table 1 Effect of Kaixin San on escape latency in AD rats

表1 開心散對AD 大鼠逃避潛伏期的影響(±s)Table 1 Effect of Kaixin San on escape latency in AD rats

注:與空白組或假手術組相比,#P<0.05;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dosage n逃避潛伏期(s)Escape latency第3 天Third day 第4 天Fourth day 第5 天Fifth day空白組Control group / 9 17.59±11.17 9.52±2.91 14.74±9.01假手術組Sham operation group / 8 19.26±5.19 10.26±8.47 8.92±3.70模型組Model group / 10 32.11±20.17# 19.11±12.74# 16.86±11.66#石杉堿甲組Huperzine A group 0.046 9 25.22±13.65 9.74±6.30△ 7.56±3.29△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 8 17.22±11.70△ 5.85±3.10△△ 10.19±4.99開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 7 16.11±4.80△△ 8.41±7.62△△ 7.76±5.44△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 10 17.02±7.20△△ 13.10±9.13 13.11±9.13

圖1 開心散對AD 大鼠逃避潛伏期的影響Note. Compared with the control group or sham operation group,# P< 0.05. Compared with the model group,△P < 0.05,△△P<0.01.Figure 1 Effect of Kaixin San on escape latency in AD rats

2.1.2 開心散對AD 大鼠空間探索能力的影響

與空白組或假手術組相比,模型組穿越平臺次數、目標象限停留時間及游泳路程所占百分比均明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05);相較于模型組,開心散中、高劑量組的穿越平臺次數增加(P<0.05);開心散低、高劑量組的目標象限停留時間與游泳路程所占百分比均明顯提升(P<0.05 或P<0.01)(結果見表2、圖2)。

圖2 開心散對AD 大鼠空間探索能力的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 2 Effect of Kaixin San on spatial exploration ability of AD rats

表2 開心散對AD 大鼠空間探索能力的影響(±s)Table 2 Effect of Kaixin San on spatial exploration ability of AD rats

表2 開心散對AD 大鼠空間探索能力的影響(±s)Table 2 Effect of Kaixin San on spatial exploration ability of AD rats

注:與空白組或假手術組相比,#P<0.05;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group, #P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dosage n穿越平臺次數(次)Number of crossing platform目標象限停留時間(s)Target quadrant residence time目標象限路程所占百分比(%)Percentage of target quadrant path空白組Control group / 9 6.56±1.88 50.79±8.47 40.27±5.71假手術組Sham operation group / 8 7.13±2.10 51.76±10.15 40.27±6.38模型組Model group / 10 5.20±2.86# 44.05±6.54# 32.93±7.78#石杉堿甲組Huperzine A group 0.0460 9 5.67±1.58 46.98±5.79 37.99±5.17開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 8 5.88±2.23 51.99±9.04△ 40.25±6.84△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 7 8.14±3.53△ 48.67±7.80 37.29±5.53開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 10 7.60±2.01△ 54.73±6.64△△ 41.92±5.05△△

2.2 開心散對AD 大鼠腦組織病理形態的影響

2.2.1 HE 染色

HE 染色結果顯示,空白組、假手術組大鼠皮層神經元邊界清晰,形態規則;海馬組織神經元數量豐富、排列緊密,形態結構正常。 與空白組相比,模型組皮層、海馬組織均可見神經元皺縮,皮質細胞數量明顯減少,細胞間隙增大;海馬組織細胞排列散亂無序,細胞層數減少,形態不規則,甚至出現核仁消失。 相較于模型組,各給藥組腦組織病理形態有不同程度的改善,皮層神經元數量增多,皺縮狀態緩解;海馬區域細胞排列較整齊,細胞層數增加,形態結構趨于正常(結果見圖3)。

圖3 開心散對AD 大鼠腦組織病理形態的影響(HE 染色)Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 3 Effect of Kaixin San on pathological morphology of brain tissue in AD rats (HE staining)

2.2.2 Nissl 染色

Nissl 染色結果顯示,空白組、假手術組大鼠皮層及海馬組織神經元排列整齊、均勻,細胞結構完整;尼氏小體數量豐富,形態正常,尼氏物質呈深藍色顆粒或斑塊狀染色。 與空白組相比,模型組皮層、海馬中尼氏小體數量明顯減少,染色變淺,神經元排列散亂且間隙明顯增大。 相較于模型組,各給藥組腦組織病理狀況有不同程度的改善,其皮層及海馬組織中尼氏小體數量增加,且海馬CA1 區細胞排列緊密整齊,胞漿著色變深(結果見圖4)。

圖4 開心散對AD 大鼠腦組織病理形態的影響(Nissl 染色)Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 4 Effect of Kaixin San on pathological morphology of brain tissue in AD rats (Nissl staining)

2.3 開心散對AD 大鼠腦組織中膽堿能神經遞質的影響

與空白組或假手術組相比,模型組大鼠腦組織中ChAT 的活性及ACh 的含量均明顯降低,AChE的活性升高,差異有統計學意義(P<0.05 或P<0.01)。 相較于模型組,開心散低、高劑量組ACh 的含量明顯增加(P<0.05 或P<0.01);石杉堿甲組、開心散低、中劑量組ChAT 的活性增強,且AChE 的活性顯著降低(P<0.05 或P<0.01)(結果見表3、圖5)。

表3 開心散對AD 大鼠膽堿能神經遞質的影響(±s,n=6)Table 3 Effect of Kaixin San on cholinergic neurotransmitter in AD rats

表3 開心散對AD 大鼠膽堿能神經遞質的影響(±s,n=6)Table 3 Effect of Kaixin San on cholinergic neurotransmitter in AD rats

注:與空白組或假手術組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage ACh(pg/mg) ChAT(ng/mg) AChE(ng/mg)空白組Control group / 5.23±0.78 126.29±22.26 0.61±0.14假手術組Sham operation group / 4.24±0.54 127.70±10.20 0.55±0.10模型組Model group / 3.84±0.98# 113.12±26.33# 0.80±0.11##石杉堿甲組Huperzine A group 0.046 4.68±0.70 174.64±23.47△△ 0.52±0.08△△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 6.13±2.19△△ 138.43±13.36△ 0.63±0.15△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 4.08±0.92 159.35±19.74△△ 0.55±0.16△△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 5.23±0.78△ 127.07±21.50 0.73±0.16

圖5 開心散對AD 大鼠膽堿能神經遞質的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01.Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 5 Effect of Kaixin San on cholinergic neurotransmitter in AD rats

2.4 開心散對AD 大鼠腦組織中炎癥因子的影響

與空白組或假手術組相比,模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β 及IL-6 等炎癥因子的含量明顯升高,差異有統計學意義(P<0.01)。 相較于模型組,石杉堿甲組、開心散低劑量組TNF-α 的含量明顯下降(P<0.05);石杉堿甲組、開心散低、中劑量組IL-1β 與IL-6 的含量顯著降低(P<0.05 或P<0.01)。(結果見表4、圖6)

表4 開心散對AD 大鼠腦組織炎癥因子的影響(±s,n=6)Table 4 Effect of Kaixin San on inflammatory factors in brain tissue of AD rats

表4 開心散對AD 大鼠腦組織炎癥因子的影響(±s,n=6)Table 4 Effect of Kaixin San on inflammatory factors in brain tissue of AD rats

注:與空白組或假手術組相比,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage TNF-α(pg/mg) IL-1β(pg/mg) IL-6(pg/mg)空白組Control group / 8.58±2.76 8.62±1.35 7.32±1.46假手術組Sham operation group / 8.38±1.53 8.24±0.86 6.32±0.58模型組Model group / 13.30±2.19## 11.51±1.26## 10.03±1.62##石杉堿甲組Huperzine A group 0.046 9.46±2.63△ 7.99±1.69△△ 7.60±1.66△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 9.52±3.37△ 9.24±1.57△ 7.23±2.00△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 13.24±2.44 8.50±2.54△△ 6.81±2.49△△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 10.22±3.10 10.63±1.75 8.35±2.31

圖6 開心散對AD 大鼠腦組織炎癥因子的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 6 Effect of Kaixin San on inflammatory factors in brain tissue of AD rats

2.5 開心散對AD 大鼠腦組織中β-淀粉樣蛋白含量的影響

與空白組或假手術組相比,模型組大鼠腦組織中APP、Aβ1-40及Aβ1-42的含量明顯升高,差異有統計學意義(P<0.05 或P<0.01);相較于模型組,石杉堿甲組、開心散低、高劑量組APP 的含量顯著下降(P<0.01);開心散中劑量組Aβ1-40的含量降低(P<0.05);石杉堿甲組、開心散中、高劑量組Aβ1-42的含量均明顯減少(P<0.05 或P<0.01)(結果見表5、圖7)。

表5 開心散對AD 大鼠腦組織中β-淀粉樣蛋白含量的影響(±s,n=6)Table 5 Effect of Kaixin San on β-amyloid protein content in brain tissue of AD rats

表5 開心散對AD 大鼠腦組織中β-淀粉樣蛋白含量的影響(±s,n=6)Table 5 Effect of Kaixin San on β-amyloid protein content in brain tissue of AD rats

注:與空白組或假手術組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage APP(ng/mg) Aβ1-40(pg/mg) Aβ1-42(pg/mg)空白組Control group / 1.07±0.20 32.25±9.67 16.43±3.53假手術組Sham operation group / 1.07±0.19 27.64±7.89 14.18±1.98模型組Model group / 1.83±0.22## 40.38±6.81# 22.25±3.64##石杉堿甲組Huperzine A group 0.046 1.09±0.16△△ 30.25±6.46 13.82±3.65△△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 1.06±0.32△△ 33.98±14.58 21.71±8.60開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 1.62±0.56 26.19±9.53△ 12.35±3.15△△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 1.24±0.37△△ 30.31±5.32 16.35±2.24△

圖7 開心散對AD 大鼠腦組織中β-淀粉樣蛋白含量的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 7 Effect of Kaixin San on β-amyloid protein content in brain tissue of AD rats

2.6 開心散對AD 大鼠腦組織中tau 蛋白磷酸化的影響

2.6.1 開心散對AD 大鼠皮層、海馬組織中tau 蛋白表達水平的影響

與空白組或假手術組相比,模型組大鼠皮層、海馬組織中tau 蛋白棕黃色陽性表達產物明顯增多,差異有統計學意義(P<0.05 或P<0.01);相較于模型組,開心散中劑量組皮層組織中tau 蛋白的陽性表達量顯著下降(P<0.05);石杉堿甲組、開心散低劑量組海馬組織中tau 蛋白的表達水平均有下調(P<0.05)(結果見表6、圖8、圖9)。

圖8 開心散對AD 大鼠腦組織中tau 蛋白表達水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05.Figure 8 Effect of Kaixin San on the expression of tau in brain tissue of AD rats

圖9 開心散對AD 大鼠腦組織中tau 蛋白表達水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 9 Effect of Kaixin San on the expression of tau in brain bissue of AD rats

表6 開心散對AD 大鼠腦組織中tau 蛋白表達水平的影響(±s,n=4)Table 6 Effect of Kaixin San on the expression of tau in brain tissue of AD rats

表6 開心散對AD 大鼠腦組織中tau 蛋白表達水平的影響(±s,n=4)Table 6 Effect of Kaixin San on the expression of tau in brain tissue of AD rats

注:與空白組或假手術組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,△P<0.05。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05,##P<0.01. Compared with the model group,△P<0.05.

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage 皮層(IOD)Cortex 海馬(IOD)Hippocampus空白組Control group / 826.97±552.16 1244.68±906.16假手術組Sham operation group / 561.62±295.79 1374.30±814.44模型組Model group / 1390.36±233.98## 2849.53±702.32#石杉堿甲組Huperzine A group 0.046 792.01±304.28 1181.80±500.61△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 928.21±408.26 1479.75±523.92△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 747.18±486.63△ 1515.77±1139.74開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 793.42±505.62 1845.28±1432.42

2.6.2 開心散對AD 大鼠皮層、海馬組織中GSK-3β 表達水平的影響

與空白組或假手術組相比,模型組大鼠皮層、海馬組織中GSK-3β 棕黃色免疫陽性產物明顯增多,差異有統計學意義(P<0.05);相較于模型組,石杉堿甲組、開心散高劑量組皮層組織中GSK-3β 陽性表達量顯著降低(P<0.05 或P<0.01);石杉堿甲組、開心散低、中、高劑量組海馬組織中GSK-3β 表達水平均下降(P<0.05 或P<0.01)。 (結果見表7、圖10、圖11)

圖10 開心散對AD 大鼠腦組織中GSK-3β 表達水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San medium dose group. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.Figure 10 Effect of Kaixin San on GSK-3β expression in brain tissue of AD rats

圖11 開心散對AD 大鼠腦組織中GSK-3β 表達水平的影響Note. A, Control group. B, Shamoperation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 11 Effect of Kaixin San on GSK-3β expression in brain tissue of AD rats

表7 開心散對AD 大鼠腦組織中GSK-3β 表達水平的影響(±s,n=4)Table 7 Effect of Kaixin San on GSK-3β expression in brain tissue of AD rats

表7 開心散對AD 大鼠腦組織中GSK-3β 表達水平的影響(±s,n=4)Table 7 Effect of Kaixin San on GSK-3β expression in brain tissue of AD rats

注:與空白組或假手術組相比,#P<0.05;與模型組相比,△P<0.05,△△P<0.01。Note. Compared with the control group or sham operation group,#P<0.05. Compared with the model group,△P<0.05,△△P<0.01.

組別Groups劑量(mg/kg)Dosage皮層(IOD)Cortex海馬(IOD)Hippocampus空白組Control group / 4693.20±2424.03 2047.70±554.39假手術組Sham operation group / 5004.02±1654.56 2421.76±1088.99模型組Model group / 8641.52±2230.49# 3967.49±1515.58#石杉堿甲組Huperzine A group 0.046 4974.27±3274.99△ 2102.58±1375.84△開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 5113.12±2794.35 1752.94±1119.70△△開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 5068.12±2072.73 2091.91±627.92△開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 2692.39±2236.57△△ 2290.97±785.73△

2.7 開心散對AD 大鼠腦組織中BCL-2 與BAX表達水平的影響

與空白組或假手術組相比,模型組大鼠腦組織中BAX 蛋白的相對表達量升高,且BCL-2/BAX 的比值下降,但差異無統計學意義(P>0.05)。 相較于模型組,各給藥組腦組織中BAX 蛋白的表達水平趨于下調(P>0.05),且BCL-2/BAX 的比值有不同程度的升高趨勢(P>0.05)(結果見表8、圖12、圖13)。

圖12 開心散對AD 大鼠腦組織中BCL-2 及BAX 表達水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group. F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 12 Effect of Kaixin San on expression of BCL-2 and BAX in brain tissue of AD rats

圖13 開心散對AD 大鼠腦組織中BCL-2 及BAX 表達水平的影響Note. A, Control group. B, Sham operation group. C, Model group. D, Huperzine A group. E, Kaixin San low dose group.F, Kaixin San medium dose group. G, Kaixin San high dose group.Figure 13 Effect of Kaixin San on expression of BCL-2 and BAX in brain tissue of AD rats

表8 開心散對AD 大鼠腦組織中BCL-2 及BAX 表達水平的影響(±s,n=4)Table 8 Effect of Kaixin San on expression of BCL-2 and BAX in brain tissue of AD rats

表8 開心散對AD 大鼠腦組織中BCL-2 及BAX 表達水平的影響(±s,n=4)Table 8 Effect of Kaixin San on expression of BCL-2 and BAX in brain tissue of AD rats

組別Groups 劑量(mg/kg)Dosage BCL-2 BAX BCL-2/BAX空白組Control group / 1.030±0.331 0.266±0.160 6.032±5.970假手術組Sham operation group / 1.004±0.296 0.312±0.183 4.478±3.089模型組Model group / 0.916±0.219 0.371±0.223 3.298±2.352石杉堿甲組Huperzine A group 0.046 0.909±0.248 0.201±0.151 6.227±4.265開心散低劑量組Kaixin San low dose group 11.480 0.938±0.374 0.186±0.132 7.675±7.486開心散中劑量組Kaixin San medium dose group 22.960 0.933±0.299 0.241±0.155 4.914±2.918開心散高劑量組Kaixin San high dose group 45.920 1.019±0.324 0.339±0.214 3.920±2.667

3 討論

Morris 水迷宮作為現今應用最廣泛的考察嚙齒類動物空間學習與長期記憶的行為學測試[13],提供了一套評估不同認知域功能的靈活方式,其中最廣為人知的隱藏平臺訓練(定位航行)和空間探索檢驗可有效評測鼠類的空間記憶與記憶保持能力[14]。本研究中,經開心散治療后,Aβ1-42造模后的大鼠水迷宮各項目的測試成績有較明顯提升,說明開心散可在一定程度上改善機體的認知導航能力。

AD 作為一類中樞神經系統漸進性衰退病癥,從起病、發展到惡化、死亡的整個過程均涉及到特有的病理生理學改變,HE 染色與Nissl 染色可通過簡單的染料組合揭示細胞細節與超微結構分布,借此可推斷神經元的功能狀態與畸變信息[15]。 病理形態觀察證實,相較于模型組,給藥組大鼠皮層、海馬組織病理狀況有所改善,神經元數量增多,尼氏小體數目增加,形態結構趨于正常,表明開心散可緩解AD 動物的腦組織損傷,恢復神經元的生理功能。

ACh 參與大腦信息處理的神經傳導,與人體的記憶行為及學習認知功能密切相關。 AD 的病變伴隨著腦內ACh 的“合成-傳遞-攝取”鏈失衡、ChAT與AChE 的活性失常,膽堿能神經系統出現明顯缺陷,進而導致機體學習記憶功能障礙[16]。 ELISA 檢測證明,經開心散干預的AD 大鼠腦組織中AChE活性降低,ChAT 與ACh 的含量上升,進一步揭示了開心散對膽堿能神經傳遞的靶向作用,間接維持ACh 合成、降解過程的動態平衡。

慢性免疫炎癥反應是AD 發生并且逐漸惡化的關鍵誘因[17-19],隨著機體年齡的增長和Aβ 的持續生成與集聚,小膠質細胞(MG)與星形膠質細胞(AS)在長期慢性活化過程中被過度激活,導致炎性細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 的大量生成與釋放,腦組織局部炎癥反應加重,神經元受損、變性甚至死亡[20]。 研究過程中觀察到,AD 大鼠經開心散治療后,腦組織中的炎癥因子含量均下降,證明開心散可抑制促炎因子的過度釋放,由此減輕腦內炎癥微環境的毒性效應。

Aβ 是由淀粉樣前體蛋白(APP)水解生成的正常代謝物,在β-分泌酶和γ-分泌酶的剪輯切割下,APP 可降解為以Aβ1-40和Aβ1-42為代表的Aβ 肽段[21]。 在健康機體內,Aβ 的產生與降解可保持動態平衡;然而當機體發生衰老、受到物理或化學損傷時,會導致“Aβ-APP”代謝鏈失常,Aβ 因此聚積沉淀形成彌漫性的神經炎斑[22]。 經給藥治療后的AD 鼠腦內Aβ 相關蛋白含量均有降低,表明開心散可減少Aβ 的異常蓄積,使其生成與清除狀態趨于平衡。

Tau 蛋白是一類與微管相關的組分,可與微管結合促進其穩定并組裝成束,協助神經細胞間的物質轉運[23]。 由于機體的衰老和致病因素的入侵,蛋白激酶如GSK-3β 活性的失衡,促使tau 蛋白的異常修飾和過度磷酸化,進而毀壞了微管的結構和穩定性,軸突運輸、信號傳導等生理功能損壞,最終導致神經元的變性死亡和癡呆的發生[24]。 開心散干預后的AD 大鼠皮層、海馬組織內tau 蛋白及其磷酸化激酶GSK-3β 的表達水平明顯下調,證明開心散可調控tau 蛋白磷酸化水平,維護中樞神經系統的正常運轉。

BCL-2 蛋白質大家族主導著細胞對誘發凋亡的各種刺激及損害的敏感性與抵抗力[25]。 根據結構同源性與功能可分為抗凋亡蛋白(以BCL-2 為代表)與促凋亡蛋白(以BAX 為代表)[26],BCL-2 與BAX 在大腦中的比例介導著神經元的存活[27]。 研究發現,開心散治療后的AD 大鼠腦組織中BAX 蛋白的表達量有所降低,且BCL-2/BAX 的比值趨于升高,表明開心散在一定程度上可干涉凋亡因子對神經元的毀傷,進而減少其凋亡的發生。

然而,本研究旨在對開心散抗癡呆的藥理活性進行全面篩查與驗證,所采用的海馬CA1 區注射Aβ1-42寡聚體致癡呆模型只能復制AD 的部分癥狀與病因,且研究所設立的指標與靶點較為寬泛,缺乏針對單一神經功能系統或完整信號蛋白通路的側重考查,還需在后續研究中加以補充探索。

由以上可知,開心散對雙側海馬CA1 區注射Aβ1-42造模大鼠的癡呆癥狀與腦組織損傷有較好的治療作用和緩解效果,其作用機制涉及到膽堿能神經遞質、炎癥因子、β-淀粉樣蛋白、tau 蛋白磷酸化水平以及凋亡因子等多靶點、多通路的靶向調控與干預,此研究也進一步證實開心散抗癡呆的藥理活性,其作為治療“好忘”的經典古方具備進一步挖掘的價值。