腫瘤心臟病學動物模型的研究進展

張 鈺孟婷婷田 鵬鄭 燕*蘇國海*

(1.山東大學,濟南 250013;2.濟南市中心醫院,濟南 250013;3.專科轉化研究中心,山東第一醫科大學附屬中心醫院,濟南 250013)

隨著抗腫瘤藥物的不斷更新,抗腫瘤療效顯著提高,腫瘤患者的病情得到好轉,但隨之而來的腫瘤本身對心功能的影響及抗腫瘤藥物相關心血管毒性卻成為腫瘤病人死亡的另一重要原因。 在此背景下,作為研究腫瘤學和心血管病學的新型交叉學科,腫瘤心臟病學(cardio-oncology)應運而生[1]。

抗腫瘤治療過程中引起的心血管毒性是腫瘤心臟病學的主要研究內容之一。 已有報道,傳統的化療藥,靶向藥、免疫檢查點抑制劑和放療等都可能會引起潛在危及生命的心血管并發癥,包括心力衰竭、高血壓、心律失常、心肌炎和心肌缺血等[1]。對其發病機制及保護性藥物的研究引起越來越多的重視,正逐漸成為該領域的研究熱點。 動物模型在其中的作用不容忽視,當前大部分體內實驗采用了嚙齒類動物構建腫瘤心臟病學模型。 然而,不同的研究中所選用的實驗動物品系,藥物劑量和評價指標存在較大差異[2]。 建立貼近于臨床的腫瘤心臟病學動物模型,對研究抗腫瘤過程中發生心血管毒性的分子機制,尋找理想的生物標志物意義重大,可幫助醫生制定合理的診療方案以預防和及時治療心血管并發癥。 本文對當前已發表的腫瘤心臟病學動物模型進行綜述,分析其特點,助力研究者構建合適的腫瘤心臟病學動物模型。

1 蒽環類藥物動物模型

蒽環類藥物是治療乳腺癌、淋巴瘤、白血病的一線用藥,應用較廣泛,包括阿霉素(doxorubicin,DOX)、柔紅霉素、表柔比星等。 蒽環類藥物引起心血管毒性發病率較高且隨著累積用藥劑量的增大,心臟毒性的風險增高,是最早引起學者關注的產生心臟毒性的抗腫瘤藥[3]。 當前研究發現蒽環類藥物激發心臟毒性的機制有以下途徑:活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生、鈣超載、脂質過氧化和線粒體功能障礙等。 相關研究的體內實驗多采用小鼠、大鼠模型,根據研究目的分為急性損傷模型和慢性損傷模型。

1.1 小鼠模型

由于存在遺傳背景清晰,操作方便,所采集的數據指標便于分析等有利因素,小鼠模型在腫瘤心臟病學研究中最為常用。 當前大部分研究蒽環類藥物動物模型采用C57BL/6 小鼠,以腹腔注射方式給藥。

1.1.1 非荷瘤小鼠模型

急性損傷模型為短期內大劑量給藥:累積劑量20～30 mg/kg 的阿霉素[4-6],在用藥后第1～2 周超聲顯示射血分數比對照組下降15%～30%,組織學檢查發現心肌細胞間有大量炎性細胞浸潤。

慢性損傷模型的給藥方案在不同課題組差異較大:給藥時間大約為2～12 周,累積劑量18～36 mg/kg 不等[7-12]。 觀測時間點差異也較大(4～13周),這與給藥方案及檢測手段的不同有關,實驗結果超聲示左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS) 比對照組下降10% ～20%,心肌壞死標志物升高等表現。 較溫和的給藥方案如3 mg/kg,每周1 次,持續12 周;與5 mg/kg,每周1 次,持續4 周相比,其監測心臟毒性的時間點較長(12 周 vs.4 周);同樣Noel 等[8]采用每周注射3 mg/kg 的用藥方案,心臟磁共振(cardiac magnetic resonance imaging,CMR)在第4 周發現異常,有明顯的細胞外體積分數(extracellular volume fraction,ECV)增加,整體縱向應變(global longitudinal strain,GLS)惡化,而另一課題組超聲在第12 周監測到心臟損傷,提示采用磁共振可更早監測到心臟損傷[11]。

比較不同課題組采取相同的給藥方式得出的結果發現[7,9],以5 mg/kg 的劑量,每周給藥1 次,累積20 mg/kg 的用藥方案,可在第4 周超聲檢測到心臟損傷,能獲得較穩定的腫瘤心臟病動物模型,降低小鼠死亡率,縮短模型建立時間。

雖然是同種系小鼠,但在不同研究中存在周齡、體重不同,及實驗室飼養條件等差異,導致小鼠對藥物的耐受性不同,所以需要更多的研究探索,盡可能控制各項可變因素,以建立合適的建模方案。

1.1.2 荷瘤小鼠模型

荷瘤鼠模型較非荷瘤鼠模型能夠更好地模擬腫瘤患者的真實情況,可同時觀察化療藥對腫瘤的治療效果及對心血管的影響。 然而由于操作較復雜,當前檢索到6 篇蒽環類藥物的荷瘤鼠模型,其中有5 篇乳腺癌模型[13-16],1 篇為肉瘤模型[17]。

乳腺癌模型中,多數報道選擇同種鼠源4T1 乳腺癌細胞,BALB/c 小鼠乳腺脂肪墊原位或皮下成瘤,其中兩項研究采用10 mg/kg 大劑量短時間給藥,累積20～30 mg/kg,在第2～3 周出現心肌損傷[14,16];另一項研究采用4 mg/kg,每周給藥1 次,持續3 周,在第6 周檢測到心肌損傷[15]。

采用C57BL/6 小鼠,E0771 乳腺癌細胞成瘤,成瘤后腹腔注射阿霉素5 mg/kg,每周給藥1 次,持續3 周,于第3～4 周檢測到心臟損傷[16]。 與非荷瘤C57BL/6 小鼠模型相比,荷瘤鼠心肌損傷出現的時間較早。

另有一項報道中,為研究人源乳腺癌,將人乳腺癌細胞TB474 接種于免疫缺陷BALB/c 小鼠建模[13],成瘤后DOX 5 mg/kg,每周給藥1 次,累積劑量40 mg/kg,于第16 周檢測到心臟損傷。

肉瘤模型為KM 鼠,采用鼠源S180 肉瘤細胞,皮下成瘤,每 d 給藥2 mg/kg,,持續10 d,成功建立急性心臟損傷模型[17]。

以上荷瘤鼠動物模型首先要成瘤,然后給予抗腫瘤藥,可觀察藥物對腫瘤和心血管的作用,對于同時研究抗癌作用和心臟保護治療提供了較為適宜的模型手段。 但由于當前報道較少,尚需要進行更多的探索,以尋找合適的建模方案(見表1)。

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表1 蒽環類小鼠動物模型Table 1Anthraceneclinemouse animal model

1.2 大鼠模型

與小鼠相比,大鼠體積大,影像學觀察更為清楚,解剖操作方便直觀,存活率也較高。 同樣,由于操作簡便,大鼠的非荷瘤模型較荷瘤模型應用廣泛。 Wistar 大鼠,SD 大鼠和Fischer(F344)大鼠均有應用,其中Wistar 大鼠使用較多(見表2)。

用藥方案多采用每隔1～3 d 腹腔注射1 次,累積9～18 mg/kg,心肌損傷指標的檢測時間在第13～14 天[18-22]。 Sergazy 等[22]采用單次大劑量(8 mg/kg)注射后第8 天檢測到心肌損傷血清標志物的異常。

有兩項研究采用尾靜脈注射的給藥方式:小劑量多次給藥(1.5 mg/kg,累積9 mg/kg)于第51 天檢測到LVEF 降低[19]。 單次尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg,第70 天超聲出現肥厚型心肌病和擴張型心肌病兩種變化[20]。 提示蒽環類藥的慢性心臟毒性不容忽視。

Todorova 課題組的研究中構建了大鼠荷瘤模型:Fischer(F344)大鼠同種乳腺癌MatBIII 細胞,乳腺脂肪墊接種成瘤。 急性損傷模型采用單次腹腔給藥12 mg/kg,3 d 后觀察到出現急性心臟損傷[23];慢性損傷模型腹腔注射2 mg/kg,1 周2 次,累積12 mg/kg,于3 周后檢測到心臟功能及心肌細胞毒性改變[24]。

總的來說,當前蒽環類腫瘤心臟病學動物模型研究較多,但仍需在不同課題組間進行比較,尋找穩定統一的建模方案,以利于課題組間進行研究結果的比較(見表2)。

表2 蒽環類大鼠動物模型Table 2 anthracycline rat model

2 免疫抑制劑類動物模型

最近幾年臨床病例顯示,免疫檢查點抑制劑(checkpoint inhibitors,ICIs)能夠有效的提高晚期腫瘤患者的生存率。 然而免疫抑制療法的心血管損傷也不容忽視,其中最顯著的損傷就是急性心肌炎[25],對其機制的研究引起了學者的廣泛關注。Tay[26]等 和Liu 等[27]的研究中采用了荷瘤小鼠模型,分別皮下注射黑色素瘤細胞和結腸癌肺轉移細胞建立荷瘤模型,腹腔注射給藥,PD-L1 抗體每只100～150 μg,PD-1 抗體每只200～250 μg,在第1 d天觀察到心肌標志物的異常升高,成功構建腫瘤心臟病動物模型。 Michel 等[28]為了研究抗PD-1 療法在治療黑色素瘤中的心臟毒性作用,每隔1 d 腹腔注射250 mg PD-1 抗體,注射6 次后檢測到小鼠LVEF 下降,整體徑向應變下降51%。 在非荷瘤鼠模型的構建中,陳振寅等[29]綜合考量小鼠的存活率和臨床患者的用藥劑量分析,實驗得出最適宜的建模方案為尾靜脈注射抗PD-L1 10 mg/kg 或抗PD-1 12.5 mg/kg ,每周1 次,在第4 周超聲示LVEF,LVFS 下降,誘發心血管損傷。 也有課題組在第1 天和第14 天分別腹腔注射PD-1 抗體5 mg/kg,在第28 天超聲觀察到LVEF 和LVFS 下降[30-31]。

3 抗血管生成靶向藥物類動物模型

新生血管的生成在腫瘤的生長和擴散起著至關重要的作用,因此血管生成抑制劑在抗腫瘤治療中應用較為廣泛。

研究報道此類的抗腫瘤藥可以誘發心力衰竭,高血壓,QT 間期延長和室性心律失常[32]。 當前研究主要針對血管生成抑制劑舒尼替尼和大分子單抗靶向藥貝伐單抗展開,均采用小鼠非荷瘤模型:舒尼替尼25～50 mg/kg,每天灌胃給藥持續2～6周[33-36]。 貝伐單抗每周靜脈給藥10 mg/kg,累積劑量20～40 mg/kg[35-36]。 小鼠模型出現心臟毒性的最早時間在用藥后的第2 周,表現為超聲顯示LVEF下降,血清肌鈣蛋白水平增高,血壓增高等變化。

4 抗HER-2 單克隆抗體類動物模型

單克隆抗體曲妥珠(赫賽汀)靶向抑制HER-2蛋白,在HER-2 過表達的乳腺癌、胃癌等的治療中較多應用,其心臟毒性的發病率在1.7%～20%。 曲妥珠單抗誘導心臟毒性的小鼠模型中,多采用腹腔注射3～10 mg/kg 的曲妥珠,累積劑量9～20 mg/kg,連續的超聲檢測,最早在第10 天可觀察到左室舒張末期內徑增加, 射血分數下降到 40%[37-40]。Olorundare 等[41]和Beiranvand 等[42]研究中采用大鼠模型,腹腔注射曲妥珠單抗的用量為2.25 ～20 mg/kg,累積劑量在15.75～60 mg/kg 范圍內,在第7 天出現血清LDH 和肌鈣蛋白水平增高,心肌組織檢測能看到有明顯的血管充血和冠狀動脈微血栓的形成。

5 其他化療藥動物模型

腫瘤治療中,各種化療藥的應用在殺傷腫瘤細胞的同時也會損傷正常組織,心肌損傷是常見的副作用之一。 多篇研究中構建了順鉑急性心臟毒性大鼠模型:腹腔注射單劑量順鉑7 mg/kg,第5 天與對照組比較可觀察到心肌標志物升高,氧化應激標志物明顯增加,提示出現心肌損害[43-45]。 Zhao等[46]用小鼠建立慢性模型,腹腔注射3～6 mg/kg 的順鉑,每周1 次,累積劑量為9 或18 mg/kg,于第24天發現3 mg/(kg·d)的小鼠心肌未見明顯改變,而6 mg/(kg·d)的小鼠超聲發現有收縮和舒張功能受損。

烷基化劑環磷酰胺也是常用的化療藥物,臨床研究發現,可誘發心肌病,心包炎甚至充血性心衰。Senthilkumar 等[47]和Viswanatha 等[48]均采用雄性Wistar 大鼠建模,分別腹腔注射150 或200 mg/kg環磷酰胺,于用藥的第10、12 天檢測到血清學心肌損傷指標出現異常。

以上傳統化療藥及靶向藥物在臨床上引起心臟毒性的概率較蒽環類藥物低,動物模型的研究相對較少。 需要結合臨床發病情況,包括發病患者的基礎疾病、用藥方案等,歸納其中的規律,尋找可能的影響因素。 在動物實驗中對各種影響因素進行考量,進行更加細致的研究探索才能建立較穩定的腫瘤心臟病模型。

6 放療動物模型

放射治療在晚期乳腺癌和一些胸部腫瘤中起到不可或缺的作用,然而超過一半的患者會發生輻射誘發的心臟功能障礙包括心包炎、缺血性心臟病、心肌纖維化,及心臟瓣膜異常 。 放療模型一般選用嚙齒類動物,10～12 周的成年雌性大鼠接受單劑量24 Gy 心臟輻射治療,CMR 檢測發現在放療后10 周出現心肌應變惡化,心肌水腫[49]。 Lee 等[50]采用小鼠連續5 d 接受每日2 Gy 的照射,10 Gy 為1個療程,5 個療程,總累積劑量為50 Gy,在照射后的18 個月小鼠心臟組織學顯示心肌纖維化。

7 小結與展望

腫瘤心臟病學作為新型交叉學科,近年來受到越來越多心血管和腫瘤學專家的關注,但學科發展仍處于起步階段,相關動物模型的研究尚存在較多問題,不同研究團隊采用的建模方式差異較大,不利于課題組間研究結果的相互比較。

當前最常見腫瘤心臟病學動物模型為嚙齒類動物模型,但大部分研究采用的非荷瘤鼠建模,雖然取得了一定的研究成果,但與荷瘤鼠模型相比,后者具有以下優勢:更能真實反映臨床患者體內的情況;荷瘤鼠模型考慮了腫瘤本身對心臟的影響和抗腫瘤藥代謝的影響,可同時評估藥物的抗腫瘤和心血管毒性作用,精確反映抗腫瘤藥在體內的作用及分子機制;更有助于尋找理想的心血管保護藥物:具有心血管保護作用的同時與抗腫瘤藥物無拮抗作用。

嚙齒類腫瘤心臟病學動物模型也存在部分不足:(1)動物心臟的重量、心肌結構、心率、心肌離子通道的狀態等方面與人類相比仍然有較大的差異。心血管表型的嚴重程度可能根據所使用的動物品系的遺傳背景不同而不同,同樣動物模型和人類患者的臨床觀察之間仍可能存在平移差距,例如,伊馬替尼在嚙齒類動物中引起心肌病,但在患者中似乎沒有同樣的效果。 未來可采用豬、猴等大型實驗動物來彌補這一不足。 (2)人類的一些基礎性疾病如高血壓,糖尿病等尚未在動物模型中有很好的體現。 可在建立穩定的荷瘤鼠心臟病模型的基礎上,進一步引入以上基礎性疾病,建立更精細的動物模型。 同時在抗腫瘤藥的給藥方式、劑量,成瘤部位,心臟保護藥物的給藥時間點等方面進行細致考量。

總之,對于新興學科腫瘤心臟病學,未來發展潛力巨大,但由于相關研究相對較少,加之存在腫瘤、抗腫瘤方案、患者的基礎疾病等的復雜多樣的影響因素,建立穩定可靠的動物模型是任重而道遠,隨著各種實驗技術的發展和檢測水平的提高,相信腫瘤心臟病學的動物模型將會更加完善,更貼切地模擬臨床特征。