特發性免疫性血小板減少癥患兒血清中ITGB3和PRDX6水平及臨床意義*

岐 錦,王 靜,姚秀坤

山西省兒童醫院(山西省婦幼保健院)：1.營養科；2.血液科，山西太原 030002；3.山西醫科大學，山西太原 030002

特發性免疫性血小板減少癥(ITP)是一種以血小板(PLT)破壞、巨核細胞成熟障礙為特征的自身免疫性疾病[1]。ITP多見于兒童，目前，激素治療和脾臟切除是治療ITP的主要方案，但少數患兒仍出現復發或對藥物不敏感等情況，使顱內出血等并發癥發生風險增加。因此，發現合適的生化指標判斷患兒的病情及預后對早期臨床干預至關重要。整合素β3(ITGB3)是一種跨膜糖蛋白受體，由788個氨基酸組成，主要存在于PLT和巨核細胞表面，具有調控細胞黏附、凋亡及遷移和介導細胞與細胞外基質的連接等功能[2]。研究表明，ITGB3能夠誘導血小板生成素活化，激活休眠中的造血干細胞(HSC)，維持HSC活性，促進PLT合成[2]。過氧化物酶(PRDX)6屬于非硒代谷胱甘肽過氧化物酶家族，其編碼基因位于染色體1q24，相對分子質量約為25 000，主要存在于細胞質中，參與氧化應激、細胞凋亡及新陳代謝等過程[3]。研究表明，PRDX6失活能夠促進巨核細胞凋亡，導致分化為PLT的數量下降，加速慢性ITP進展[3]。目前ITGB3和PRDX6在ITP中的報道少見，且與疾病嚴重程度和預后關系尚不清楚。因此，本研究旨在探討ITP患兒血清中ITGB3和PRDX6水平及與疾病嚴重程度和預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2021年8月山西省婦幼保健院收治的73例ITP患兒作為ITP組，同時選取70例相同年齡層來院體檢的健康兒童作為對照組。ITP組中男32例、女41例，年齡1～11歲、平均(6.27±1.96)歲；對照組中男31例、女39例，年齡2～10歲、平均(6.33±1.78)歲。兩組的年齡、性別差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。ITP患兒納入標準：(1)符合ITP診斷標準[4]；(2)均為首次診斷ITP，且病程<4周；(3)既往未接受過激素或丙種球蛋白類藥物治療。排除標準：(1)伴有凝血功能障礙疾病，如：彌漫性血管內凝血、血友病及先天性凝血因子缺乏癥等；(2)肝、腎功能障礙；(3)伴有先天或后天性免疫功能異常。本研究經山西省婦幼保健院倫理委員會批準，所有研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液指標的檢測方法 所有研究對象均于空腹狀態下采集10 mL靜脈血置于抗凝管中。其中5 mL血液標本通過離心機(生產廠家：美國Labnet公司；型號：SCI-12)離心，離心條件為6 000 r/min(4 ℃)、離心半徑10 cm、離心時間5 min，收集上清液，采用MC-6600全自動血常規分析儀(生產廠家：深圳市美思康電子有限公司)檢測PLT計數，通過酶聯免疫吸附試驗檢測血清中ITGB3和PRDX6水平。嚴格遵照試劑盒說明書進行操作。剩余的5 mL血液標本采用全光譜流式細胞儀(生產廠家：Cytek公司；型號：Aurora 3L)檢測CD4+T細胞 /CD8+T細胞比值。將標本使用乙二胺四乙酸二鈉進行抗凝，每個試管均加入20 μL的單克隆抗體，混勻后室溫避光染色10～15 min，使用磷酸鹽緩沖液洗滌1遍，棄上清液后加入磷酸鹽緩沖液重懸細胞0.5 mL，之后加入肝素抗凝，用流式細胞儀檢測。

1.2.2ITP嚴重程度分級 (1)輕度：PLT計數為(20～100)×109/L，小瘀斑和出血點較少。(2)中度：PLT計數為(10～20)×109/L，大瘀斑(直徑>5 cm)和出血點較多，伴有牙齦、鼻、消化道反復出血，偶見血尿、血便及咳血表現。(3)重度：PLT計數<10×109/L，全身廣泛大瘀斑和出血點，伴有牙齦、口腔及咽部持續性出血，偶見內臟出血或顱內出血[5]。

1.2.3ITP的治療方法及預后評估 (1)對于PLT計數≥20×109/L且無內臟出血者，采用地塞米松(生產企業：廣東華南藥業集團有限公司；批準文號：國藥準字H44024469)治療，靜脈注射，劑量為1 mg/(kg·d)，最大劑量≤15 mg。當PLT計數恢復正常后，采用潑尼松(生產企業：華中藥業股份有限公司；批準文號：國藥準字H42021394)治療，口服，初始劑量為1.5～2.0 mg/(kg·d)，逐漸減量至停用。(2)對于PLT計數<20×109/L或伴有內臟出血者，采用地塞米松聯合丙種球蛋白(生產企業：華蘭生物工程股份有限公司；批準文號：國藥準字S10970034)治療。地塞米松用法、用量與(1)中一致。丙種球蛋白的劑量為400 mg/(kg·d)，靜脈注射。當血PLT計數恢復正常后，采用潑尼松口服，用法、用量與(1)中一致。(3)若(1)和(2)在經過2周治療后，尚未達到理想療效，則采用甲潑尼龍(生產企業：天津天藥藥業股份有限公司；批準文號：國藥準字H20020223)實施沖擊治療，劑量為10 mg/(kg·d)，連續使用5 d，再次評估PLT計數，采用(1)或(2)中的治療方案。此外，在治療期間進行針對性的飲食管理，如：改善飲食結構、低鈉低膽固醇飲食、多食用含鐵的綠葉蔬菜及增加攝入含有凝血止血成分的食物(銀耳、紅棗、紅衣花生及荷葉等)。治療周期為4周，若PLT計數未升高，且臨床癥狀未改善，則判斷為預后不良[5]。

2 結 果

2.1兩組研究對象血液指標的比較 ITP組PLT計數、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平均較對照組明顯下降(P<0.05)，見表1。

表1 兩組研究對象血液指標的比較

2.2不同嚴重程度ITP患兒各項血液指標的比較 重度患兒PLT計數、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平均低于中度及輕度患兒，差異均有統計學意義(P<0.05)；中度患兒PLT計數、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值及血清中ITGB3、PRDX6水平低于輕度患兒，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同嚴重程度ITP患兒各項血液指標的比較

2.3血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計數、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值的相關性 血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計數、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值均呈正相關(r>0，P<0.05)，見表3。

表3 血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計數、CD4+T細胞/CD8+T細胞比值的相關性

2.4不同預后情況的ITP患兒血清中ITGB3、PRDX6水平差異 經治療，預后良好患兒64例，預后不良患兒9例。預后不良患兒血清中ITGB3、PRDX6水平較預后良好患兒明顯下降(P<0.05)，見表4。

表4 不同預后情況的ITP患兒血清中ITGB3、PRDX6水平比較

2.5血清ITGB3、PRDX6水平對ITP患兒預后不良的診斷價值 以ITP患兒是否出現預后不良為前提繪制ROC曲線。ITGB3、PRDX6判斷ITP患兒預后不良的最佳截斷值分別為105.31 pg/mL、28.98 pg/mL，曲線下面積(AUC)分別為0.786、0.741(Z=3.824，P<0.05；Z=2.841，P<0.05)。兩指標聯合檢測判斷ITP患兒預后不良的AUC為0.852(Z=6.799，P<0.05)，其靈敏度和特異度分別為88.89%和78.12%。見表5和圖1。

表5 血清ITGB3、PRDX6水平對ITP患兒預后不良的診斷價值

圖1 血清ITGB3、PRDX6水平診斷ITP患兒預后不良的ROC曲線

3 討 論

兒童ITP的具體發病機制與機體免疫失耐受所致的血小板破壞及生成不足有關。皮膚黏膜出血、牙齦出血及鼻出血是ITP的主要臨床表現，嚴重者可能出現內臟出血或顱內出血，危及患者生命。目前，PLT計數是判斷ITP嚴重程度的常用指標，但也有其局限性，而針對ITP的預后評估尚無法做出有效判斷。因此，為了幫助臨床在早期采用更加合理的治療方案，探索合適的生化指標輔助評估ITP的預后情況是必要的。

ITGB3又稱CD61，是一種Ca2+依賴的異源二聚體復合物，相對分子質量為(90～110)×103，其編碼基因位于17號染色體，包括αvβ3 和αⅡbβ3兩種類型，參與調節胚胎發育、傷口愈合、凝血止血及免疫應答等病理生理過程[6]。BERTRAM等[7]發現，在拮抗ITGB3后，小鼠腦血管內皮細胞大量凋亡，血管密度減低，血管生成相關因子沉默，從而導致顱內出血。在ITGB3基因缺失的小鼠中，循環血管生成細胞分化減少，同時對損傷的內皮細胞下膜的黏附性降低，無法與纖維蛋白原結合，提高了血管滲血或出血的風險[6]。本研究結果表明，ITP組血清中ITGB3水平較對照組明顯下降(P<0.05)，提示ITGB3可能是影響ITP發病的重要因素。其原因可能是抗PLT自身抗體能夠特異性識別PLT表面的ITGB3，抗體與ITGB3結合后，誘導巨噬細胞將其吞噬分解，使血清中的ITGB3水平降低[8]。本研究結果顯示，隨著ITP嚴重程度的增加，血清中ITGB3水平逐漸降低(P<0.05)，提示ITGB3可能參與了ITP的進展。其機制可能是血清中ITGB3水平降低后，其自身的ICY 結構域失活，發生去磷酸化，阻礙信號轉導蛋白和細胞骨架蛋白肌球蛋白在糖蛋白(GP)Ⅱb /Ⅲa結構域中積聚，從而使PLT活性喪失，加重ITP病情[8]。此外，ITGB3失活能夠誘導內皮細胞凋亡，使血管通透性增加，同時，內皮細胞凋亡使機體凝血系統異常，PLT合成受阻，導致血清中PLT計數下降[2,9]。

PRDX6是僅含有1個保守半胱氨酸(Cys)殘基的PRDX超家族成員，包含224個氨基酸，同時具有磷脂酶A2(PLA2)和谷胱甘肽(GSH)過氧化物酶功能，在抵御細胞膜表面氧化應激損傷方面發揮重要作用[10]。VRBENSKY等[10]研究發現，當PRDX6失活時，白細胞介素-1表達增加，促進腫瘤壞死因子釋放，抑制花生四烯酸合成，阻礙PLT激活，并誘導血管內皮細胞凋亡。動物實驗表明，在PRDX6基因敲除的大鼠體內，炎癥細胞浸潤程度增加，促進活性氧(ROS)釋放，抑制PLT生長因子活性，提高大鼠肺泡出血風險[11]。本研究結果表明，ITP組血清中PRDX6水平較對照組明顯下降(P<0.05)，提示PRDX6可能在ITP發病過程中起到重要作用。其原因可能是PRDX6基因啟動子沉默，無法轉錄合成PRDX6，造成血清中PRDX6水平下降，但其具體調控機制尚不清楚[12]。本研究結果表明，隨著ITP嚴重程度的增加，血清中PRDX6水平逐漸降低(P<0.05)，提示PRDX6可能在ITP進展具有調控作用。其原因可能是PRDX6下調后能夠激活絲/蘇氨酸激酶(AKT)信號通路，促進促凋亡蛋白Bad磷酸化，誘導PLT失活，促進ITP進展[12]。此外，PRDX6活性降低能夠使ROS大量合成，促進線粒體去極化，使內環境處于氧化還原狀態，各種凋亡相關蛋白被激活，促進PLT凋亡[13]。

本研究結果表明，血清中ITGB3、PRDX6水平與PLT計數、CD4+T細胞 /CD8+T細胞比值均呈正相關(P<0.05)，提示血清中ITGB3、PRDX6水平能夠在一定程度上反映機體免疫應答狀態和血液中PLT含量。其機制可能是ITGB3水平降低能夠促進內皮細胞凋亡，使細胞間黏附分子-1(ICAM-1)下調，抑制CD4+T細胞活性，導致CD4+T細胞 /CD8+T細胞比值失衡，誘導B淋巴細胞產生識別PLT的特異性抗體，破壞血管內的PLT[14]。PRDX6下調后無法消耗ROS，導致機體內ROS水平明顯上升，使CD4+T細胞對有絲分裂原不應答，抑制其分裂、增殖，使CD4+T細胞/CD8+T細胞比值下降，同時，過量的ROS通過氧化應激反應使巨核細胞的細胞膜受損，無法分化PLT，導致PLT計數下降[15]。本研究中預后不良患兒血清中ITGB3、PRDX6水平均較預后良好患兒明顯下降(P<0.05)，提示ITGB3和PRDX6水平可能影響ITP患兒的預后情況，對輔助臨床早期篩查具有重要意義。ROC曲線顯示，ITGB3和PRDX6聯合檢測判斷ITP患兒預后不良的AUC明顯高于ITGB3、PRDX6單一檢測的AUC，靈敏度和特異度分別為88.89%和78.12%，提示兩指標聯合檢測能夠提高對ITP患兒是否發生預后不良的診斷價值，同時，聯合檢測的靈敏度明顯高于單一指標檢測，有利于早期篩查可能發生預后不良的患兒，為臨床早期進行針對性治療提供可靠支持。

綜上所述，ITP患兒血清中ITGB3和PRDX6水平降低。同時，血清中ITGB3和PRDX6水平能夠反映機體免疫應答狀態和PLT計數。這兩指標聯合檢測對ITP患兒是否發生預后不良具有良好的診斷效能，且靈敏度較高，為臨床早期針對性治療提供幫助。但受試驗設備的限制，血清中ITGB3和PRDX6水平變化的具體機制尚不清楚，需要在后續的基礎實驗中進一步證實。