外周血單核細胞NLRP3在冠狀動脈支架術后再狹窄患者中的表達水平及臨床意義*

徐 為，羅 浩△，唐 輝

1.陸軍軍醫大學大坪醫院心血管內科，重慶 400042；2.重慶市雙橋經濟技術開發區人民醫院心血管內科，重慶 400999

經皮冠狀動脈介入治療(PCI)是阻塞性冠狀動脈疾病最有效的治療手段之一，可明顯降低患者病死率并改善患者生活質量[1]。然而支架植入狹窄的冠狀動脈管腔，雖然改善了心肌血供，但術后支架內再狹窄(ISR)仍不可避免，高達30%的裸金屬支架(BMS)植入患者1年內會發生ISR，即使藥物洗脫支架(DES)的使用顯著減少了ISR的發生率，但臨床研究發現其1年內ISR發生率仍在5%～10%[2]。ISR發生的原因在于球囊擴張和支架植入引起的血管內皮損傷，進一步促進血管平滑肌細胞表型轉換(由收縮型轉換為分泌型)，導致新生內膜形成[3]。該過程涉及眾多機制，如細胞周期蛋白的激活或抑制、炎癥反應、細胞凋亡、表觀遺傳學修飾等[4-5]。近年來相關研究顯示，NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎性小體的激活與動脈粥樣硬化的發生、發展密切相關，通過抑制NLRP3炎性小體活性，可顯著降低血管平滑肌細胞的增殖能力，改善斑塊的穩定性[6]。對于ISR患者體內NLRP3炎性小體表達水平如何，目前尚無相關研究闡明。因此，本研究旨在觀察外周血單核細胞NLRP3炎性小體在ISR患者體內的水平變化，探討其與ISR發生的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2018年1月至2020年1月在陸軍軍醫大學大坪醫院就診并成功接受冠狀動脈內DES植入術并在術后10～12個月行冠狀動脈造影復查的患者215例，其中男122例、女93例，平均年齡(70.4±9.0)歲。納入標準：所有患者均滿足冠心病診治指南[7]并達到冠狀動脈支架植入標準；術后10～12個月在陸軍軍醫大學大坪醫院行冠狀動脈造影復查；規律服用抗血小板及調脂藥物；其中對于ISR患者，需滿足ISR診斷標準，其定義為原支架內或支架兩端5 mm內狹窄程度≥50%。排除標準：術中及術后1年內死亡的患者；嚴重肝腎功能不全；既往行冠狀動脈旁路移植術；合并感染、自身免疫性疾病的患者。根據冠狀動脈造影檢查結果評估是否存在ISR，分為ISR組(52例)和非ISR組(163例)。該研究獲得陸軍軍醫大學大坪醫院倫理委員會批準，并征得了患者家屬知情同意。

1.2主要器械與試劑 人淋巴細胞分離液(上海生工生物工程有限公司)；離心機(美國Thermofisher公司)；引物(上海生工生物工程有限公司)；反轉錄試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；熒光定量PCR儀(美國伯樂公司)。

1.3方法

1.3.1一般資料收集 收集患者一般資料，包括性別、年齡、體質量指數、吸煙史、家族史、基礎疾病、冠心病分型、冠狀動脈病變部位、冠狀動脈病變支數、植入支架枚數及植入前后心肌梗死溶栓治療(TIMI)分級。

1.3.2檢測外周血單核細胞NLRP3 mRNA水平 入院當天收集患者外周血3 mL，置入乙二胺四乙酸抗凝管靜置，按1∶1比例將人外周血與淋巴細胞分離液混合，在3 000 r/min轉速下離心10 min，吸取中層白膜層細胞即為單核細胞。采用反轉錄定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測NLRP3 mRNA相對水平，首先提取總RNA進行反轉錄，NLRP3上游引物：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′，下游引物：5′-GCTTCAGTCCCACACAGA-3′；內參GAPDH上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3′，下游引物：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。建立20 μL反應體系，反應條件：預變性，95 ℃ 120 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以GAPDH為內參，使用2-ΔΔCt方法計算NLRP3 mRNA相對水平。

2 結 果

2.1兩組患者外周血單核細胞NLRP3 mRNA相對水平比較 ISR組外周血單核細胞NLRP3 mRNA相對水平為2.23±0.65，明顯高于非ISR組的1.08±0.31，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1、2。

圖1 兩組患者外周血單核細胞NLRP3 mRNA相對水平比較

2.2兩組一般資料比較 結果顯示，ISR組與非ISR組在基礎疾病糖尿病、高脂血癥的比例，以及急性冠脈綜合征、冠狀動脈病變支數≥2支、植入支架枚數≥2枚、植入后TIMI分級>2級的比例比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。兩組患者在性別、年齡、體質量指數及有吸煙史、有家族史、基礎疾病高血壓比例等方面比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.3Logistic回歸分析 以ISR發生為因變量，將2.1及2.2中差異有統計學意義的指標為自變量，行Logistic回歸分析，結果顯示患有糖尿病、植入支架枚數≥2枚、植入后TIMI分級≤2級及NLRP3 mRNA相對水平升高是ISR發生的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

圖2 兩組患者外周血單核細胞NLRP3 mRNA表達差異的電泳圖

表2 ISR發生的獨立危險因素分析

2.4ROC曲線分析 ROC曲線分析表明，外周血單核細胞NLRP3 mRNA診斷ISR的AUC為0.778(95%CI：0.677～0.878)，最佳臨界點為1.53，靈敏度和特異度分別為77.27%和61.29%，見圖3。

圖3 NLRP3 mRNA診斷ISR的ROC曲線分析

3 討 論

冠心病是最常見的動脈粥樣硬化疾病之一，對人民群眾的生命健康構成嚴重威脅。目前，PCI是治療冠心病的主要方法，但在PCI過程中，球囊對靶血管狹窄部位的擴張，可損傷內皮細胞，導致血小板在局部聚集，從而激活單核細胞黏附于內皮下，促進血管平滑肌細胞的增殖和泡沫化，導致新生內膜形成，這是引起ISR發生的重要原因之一[8]。目前，如何早期預測ISR的發生，對于其防治具有重要的臨床意義。有研究顯示，microRNA如miR-126、miR-224、載脂蛋白A及半胱氨酸等，與ISR形成具有一定相關性，是ISR發生的獨立預測因素[9-10]。但上述指標的相關臨床研究證據仍偏少，部分指標靈敏度或特異度偏低，無法有效預測ISR的形成。

支架內新生內膜增生的特點是血管內側平滑肌細胞異常的增殖和遷移，導致支架局部管腔面積減少。既往研究表明炎癥反應的激活參與了新生內膜的形成，抑制炎癥反應如NLRP3、NF-κB通路，可顯著減少小鼠頸動脈損傷和靜脈移植后新生內膜形成[11-12]。在炎癥激活的條件下，血管平滑肌細胞可分化為巨噬細胞，并伴有血管平滑肌細胞α-肌動蛋白表達的降低，表明炎癥的激活可能在血管平滑肌細胞表型轉換中發揮重要作用[13]。此外，巨噬細胞的增加可導致局部炎癥和促進血管平滑肌細胞增殖效應的相關細胞因子如成纖維細胞生長因子、血小板源生長因子等的合成與釋放，從而進一步促進血管平滑肌細胞異常增殖[14]。外周血單核細胞的激活，是全身炎癥反應的重要標志，有研究顯示動脈粥樣硬化患者單核細胞可顯著激活，該激活程度與斑塊的穩定性密切相關[15]。對于ISR患者，體內單核細胞NLRP3炎性小體表達水平如何，是否與ISR的發生相關，相關研究較少。本研究結果顯示，與非ISR組比較，ISR組患者外周血單核細胞NLRP3 mRNA相對水平顯著升高，提示ISR組患者體內NLRP3炎性小體處于激活狀態。既往針對ISR發生的危險因素的相關研究較多，已有的研究發現血脂水平升高、合并糖尿病、冠狀動脈病變重及吸煙等均可能是引起ISR發生的危險因素[16-17]。本研究結果顯示：植入支架枚數≥2枚、植入后TIMI分級≤2級及NLRP3 mRNA相對水平升高是ISR發生的獨立危險因素；而高血脂、吸煙等因素，雖然在ISR和非ISR組間存在差異，但上述因素并不是ISR發生的獨立危險因素，與張春艷等[18]研究存在一定差異，其原因可能與回顧性分析的樣本量、回訪就診的時間等差異有關。進一步評估外周血單核細胞NLRP3 mRNA水平診斷ISR的價值，通過ROC曲線分析顯示，其對ISR的診斷價值較高，同時具有較高的靈敏度和特異度。NLRP3作為一項生化指標，對ISR患者早期評估，顯示出了較強的臨床運用前景。NLRP3炎性小體激活是ISR發生的獨立危險因素，這可能與NLRP3的激活可促進下游炎性因子IL-1β水平的增加，IL-1β可招募中性粒細胞、細胞內黏附分子-1等至受損血管內皮處，致使血管通透性增加，同時還可增加纖溶酶激活物抑制物1和纖維蛋白原水平，促進血栓形成等有關[19]。

綜上所述，本研究結果顯示，外周血單核細胞NLRP3炎性小體的激活是ISR發生的獨立危險因素，通過檢測患者外周血單核細胞NLRP3 mRNA相對水平，對ISR發生的早期預測具有一定臨床價值。本研究局限性：(1)單核細胞NLRP3炎性小體及下游相關通路的激活及調控機制目前未充分闡明，如何調控并靶向抑制NLRP3炎性小體，是下一步研究的方向；(2)本研究回顧性分析的病例量偏少，可能會對研究結果產生影響。