血清miR-30b、miR-199a在新生兒缺氧缺血性腦病患兒中的表達及意義*

楊 欣，魯利群，賀 靜，黃 莉，汪 燕

成都醫學院第一附屬醫院兒科，四川成都 610500

新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)是導致新生兒死亡及神經系統發育障礙的重要因素。有研究表明，約有50%的腦癱患兒是由于HIE所引起[1]。目前研究發現，早期對HIE進行治療能夠改善HIE患兒預后[2]，因此尋找HIE早期診斷的生物學標志物具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類具有調控功能的內源性小RNA分子，參與機體多種生理、病理過程[3]。研究表明，miR-30b、miR-199a在神經系統疾病中存在異常表達，與神經系統病變有密切關系[4-6]。神經元特異性烯醇化酶(NSE)、S100B蛋白、信號素3A(SEM3A)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)均是與神經系統疾病有密切關系的蛋白[7-9]。但目前關于血清miR-30b、miR-199a表達水平與HIE患兒神經損傷和預后的關系鮮有報道。本研究擬探討血清miR-30b、miR-199a在HIE患兒中的表達及意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2020年6月本院收治的HIE患兒90例。納入標準：(1)符合HIE的診斷標準[10]；(2)足月出生兒，胎齡37～42周；(3)母體妊娠期間無嚴重并發癥。排除標準：(1)先天性顱腦畸形者；(2)伴有顱內出血者；(3)合并腦組織感染者；(4)合并會影響研究結果的其他系統疾病者。根據患兒病情程度將其分為輕度組29例、中度組36例、重度組25例。另選擇同期在本院出生的足月健康新生兒30例作為對照組。各組基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。入組新生兒家屬均了解本研究內容并簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1檢測標本采集及保存 于分娩后24 h內采集所有受試新生兒外周靜脈血4 mL，在室溫條件下靜置10 min后，以4 000 r/min離心10 min，離心半徑為12 cm，分離血清，并將分離的血清編號保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.2血清miR-30b、miR-199a表達水平檢測 應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測血清miR-30b、miR-199a表達水平。取新生兒外周靜脈血血清1 mL，應用Trizol法提取血清總RNA，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司(生產批號20190392)，應用分光光度計測量樣品濃度，再應用Taq Man RT kit(日本Takara公司生產，批號：190284)進行反轉錄，提取總RNA。應用TaqMan microRNA assay(廣州銳博生物公司生產，批號190528)進行擴增反應，以U6為內參，引物序列由廣州銳博有限公司合成，見表2。反應體系：cDNA底物1.33 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00 μL，TaqMan microRNA assay 1.00 μL，ddH2O 7.67 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共計45個循環，每個指標設置3個復孔重復3次，完成后通過2-ΔΔCt法計算miR-30b、miR-199a表達水平。

表2 miR-30b、miR-199a及內參U6的引物序列

1.2.3血清NSE、S100B蛋白、SEM3A、PAI-1水平檢測 取剩余血清中1 mL應用電化學發光法測定血清NSE水平，測定儀器為羅氏ELecsys2017電化學發光儀，試劑盒購自羅氏公司，批號：180359J；應用酶聯免疫吸附試驗測定血清S100B蛋白、SEM3A、PAI-1水平，試劑盒購自上海紀寧實業有限公司，批號：180719、180213、181104。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4神經功能評估 于出生后30 d應用新生兒20項行為神經(NBNA)評分[11]評估所有受試新生兒的神經功能，該評分系統包括一般評估3項、行為能力6項、肌張力8項、原始反射3項，共20項，總分40分，評分越高表明神經功能越好。

1.2.5隨訪及預后評估 所有HIE患兒以門診復查的形式隨訪1年，觀察記錄患兒神經發育情況。根據患兒預后情況將其分為預后良好組和預后不良組。患兒無神經系統異常、無智力缺陷為預后良好；存在腦癱、癲癇等神經系統疾病、智力缺陷或死亡則為預后不良。

2 結 果

2.1各組血清miR-30b、miR-199a表達水平及神經功能、神經損傷指標水平比較 HIE患兒的血清miR-30b、miR-199a表達水平及NBNA評分低于對照組(P<0.05)；趨勢檢驗顯示病情越重，HIE患兒的血清miR-30b、miR-199a表達水平及NBNA評分越低(P<0.05)。HIE患兒的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平高于對照組(P<0.05)；趨勢檢驗顯示病情越重，HIE患兒的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平越高(P<0.05)。見表3、4。HIE患兒血清miR-30b、miR-199a及內參U6 qRT-PCR擴增曲線見圖1～3。

圖1 miR-30b qRT-PCR擴增曲線

表3 各組血清miR-30b、miR-199a表達水平比較

表4 各組血清神經功能及神經損傷指標水平比較

續表4 各組血清神經功能及神經損傷指標水平比較

2.2HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達與神經功能及神經損傷指標水平的相關性 Pearson相關分析顯示，HIE患兒血清miR-30b表達與NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平呈負相關(r<0，P<0.05)，與NBNA評分呈正相關(r>0，P<0.05)；血清miR-199a表達與NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平呈負相關(r<0，P<0.05)，與NBNA評分呈正相關(r>0，P<0.05)。見表5。

表5 HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達與神經功能及神經損傷指標水平的相關性

2.3不同預后HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達及神經功能、神經損傷指標水平比較 共87例患兒完成隨訪，失訪3例，根據患兒預后情況將其分為預后良好組60例，預后不良組27例。預后不良組的血清miR-30b、miR-199a表達水平及NBNA評分明顯低于預后良好組，NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平則明顯高于預后良好組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表6。

圖2 miR-199a qRT-PCR擴增曲線

圖3 U6 qRT-PCR擴增曲線

2.4影響HIE患兒預后的多因素Logistic回歸分析 建立多因素非條件Logistic回歸模型，以本研究HIE患兒為樣本，HIE患兒的預后情況為因變量(預后良好=0，預后不良=1)，以表6中差異有統計學意義的指標為自變量，并以所有HIE患兒各指標均值為臨界值(根據實際情況適當取整)，將各指標轉化成二分類變量，賦值見表7。回歸采用逐表后退法，α進=0.05，α退=0.10。回歸結果顯示：NSE≥35 g/L、S100B≥100 ng/L、SEM3A≥45 ng/mL、PAI-1≥100 pg/mL是HIE患兒預后不良的危險因素(P<0.05)，miR-30b≥0.85、miR-199a≥1.25、NBNA評分≥32分則是HIE患兒預后不良的保護因素(P<0.05)，見表7。

表6 不同預后HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達及神經功能、神經損傷指標水平比較

表7 影響HIE患兒預后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

HIE是導致新生兒神經系統功能障礙和殘疾的嚴重疾病，其致殘率和致死率均較高，患兒常遺留共濟失調、腦癱、癲癇和智力障礙等后遺癥，不僅給患兒的健康帶來嚴重的威脅，也給家庭和社會帶來了沉重的負擔。HIE的早期診斷并及時對患兒的神經損傷程度進行判斷，有助于降低患兒病死率，改善預后。目前臨床上對于HIE的診斷主要包括顱腦超聲檢查、頭顱CT檢查、腦干聽覺誘發電位檢查及血清學檢測等[12]。其中血清學檢測具有操作簡單、診斷迅速、可重復觀察的優點，并且血清學指標的動態變化可以反映疾病發展情況，受到臨床醫生的青睞。

miRNA是一類單鏈非編碼RNA，可以在組織和血液中穩定存在。研究表明，miRNA可以與靶基因的3′非編碼序列結合，調控基因表達[13]。目前已有研究發現，在新生兒HIE發生、發展中存在miRNA的異常表達，影響HIE的發展和患兒的預后[14]。PAGACZ等[15]報道，當腦組織缺氧后有23種miRNA表達上調、32種miRNA表達下調。miR-30b和miR-199a均是與大腦神經功能密切相關的miRNA。SONG等[16]研究指出，miR-30b可以通過調控多種蛋白和信號通路影響大腦突觸功能，進而影響阿爾茨海默病患者的認知功能，并在大腦神經退行性病變的發生、發展中起到重要作用。miR-199a與大腦神經功能及組織缺氧有密切關系。TIAN等[17]報道，miR-199a具有促進血管內皮新生的功能。LE等[18]研究指出，miR-199a下降可以引起血管內皮功能失調，并導致血流供應障礙。SUN等[19]報道，當組織發生缺氧時，miR-199a表達水平顯著降低，引起組織中缺氧誘導因子水平升高。本研究結果發現，HIE患兒血清miR-30b、miR-199a低表達，并與HIE的病情密切相關，病情越重，患兒血清miR-30b、miR-199a表達水平越低，推測當發生HIE時，腦組織缺氧缺血，導致miR-30b、miR-199a水平降低。miR-30b可以通過調控信號通路影響與神經功能相關的蛋白，加重神經元損傷，而miR-199a則可能通過引起血管內皮功能失調，引起腦組織血流供應障礙，加重患兒腦組織損傷。

本研究結果還發現，HIE患兒的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平高于對照組；趨勢檢驗顯示病情越重，HIE患兒的NSE、S100B、SEM3A、PAI-1水平越高。NSE主要存在于神經細胞的胞質內及神經內分泌組織中，與神經系統的增殖、分化和代謝有密切關系[20]。S100B是一類特異性鈣結合蛋白，主要存在于中樞神經系統垂體前葉細胞和星形膠質細胞中[21]。當發生HIE時，神經細胞發生缺氧損傷，血清內NSE、S100B水平升高[22]。SEM3A是一種以半胱氨酸富集區域為特征的分泌型蛋白，具有調控神經軸突生長、發育的功能[23]。PAI-1是一種促進血栓形成的因子，與心腦血管疾病的發生有密切關系[24]。筆者推測，當發生HIE時，腦血管發生缺血缺氧，PAI-1水平升高，并進一步引起腦血管內皮損傷，促進微血栓形成[25]。而HIE患兒SEM3A水平升高可能是一種代償性升高，表明此時神經元受到損傷。通過NBNA評分可以了解新生兒行為能力，并能早期發現顱腦損傷。NBNA評分由20項內容組成，評分越低表明神經功能受損越嚴重[26]。本研究HIE患兒NBNA評分低于對照組，趨勢檢驗顯示病情越重，HIE患兒NBNA評分越低，表明患兒神經功能受損也逐漸加重。

KHANDELWAL等[27]研究報道SEM3A是miR-30b的調控靶基因。而LUCA等[28]報道PAI-1是miR-199a的調控靶基因。本研究中，HIE患兒血清miR-30b表達與SEM3A水平呈負相關，也提示miR-30b水平降低后可能導致其對SEM3A的抑制作用降低，導致SEM3A水平升高。miR-199a表達與血清PAI-1水平呈負相關，則提示miR-199a水平降低后可能導致其對PAI-1抑制作用降低，PAI-1水平升高，促進血栓形成從而促進HIE的發展。另外，HIE患兒血清miR-30b表達與NSE、S100B、PAI-1水平呈負相關，與NBNA評分呈正相關；血清miR-199a表達與NSE、S100B、SEM3A水平呈負相關，與NBNA評分呈正相關。這也提示miR-30b、miR-199a、NSE、S100B、SEM3A、PAI-1可能共同參與了HIE的發生和發展，其具體機制仍有待于今后深入研究。

本研究多因素分析得出：NSE≥35 g/L、S100B≥100 ng/L、SEM3A≥45 ng/mL、PAI-1≥100 pg/mL是HIE患兒預后不良的危險因素(P<0.05)，miR-30b≥0.85、miR-199a≥1.25、NBNA評分≥32分則是HIE患兒預后不良的保護因素(P<0.05)，提示通過對HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達水平進行觀測，可以為HIE患兒的預后評估提供一定依據。

綜上所述，本研究發現，HIE患兒血清miR-30b、miR-199a表達水平異常降低，且患兒神經損傷程度越嚴重其表達水平越低。miR-30b、miR-199a、NSE、S100B、SEM3A、PAI-1可能共同參與了HIE的發生和發展。血清miR-30b、miR-199a的表達水平對HIE的診斷和預后判斷具有一定參考價值。