鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥性與外排泵基因、外膜孔蛋白基因的相關(guān)性研究*

陳榮忠，楊子依，向 蓉△

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東中山 528415；2.邵陽(yáng)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，湖南邵陽(yáng) 422000

鮑曼不動(dòng)桿菌為革蘭陰性球桿菌，常存在于人體的皮膚、口腔、呼吸道、胃腸道和泌尿道中，在自然環(huán)境中分布廣泛，可存在于醫(yī)院各種環(huán)境中，近些年來(lái)已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一。鮑曼不動(dòng)桿菌具有多種耐藥機(jī)制，隨著抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出率及耐藥率居高不下，2020年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)美羅培南的耐藥率為73.4%[1]。碳青霉烯酶的產(chǎn)生是耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的鮑曼不動(dòng)桿菌(CRABA)的主要耐藥機(jī)制，而主動(dòng)外排泵系統(tǒng)的表達(dá)以及外膜孔道蛋白的丟失或突變也是其重要的耐藥機(jī)制之一。本文通過(guò)分析鮑曼不動(dòng)桿菌主動(dòng)外排泵相關(guān)基因以及外膜孔蛋白carO基因的表達(dá)，進(jìn)一步探討CRABA菌株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的分子流行病學(xué)情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集廣東省中山市西北部區(qū)域2019年1月至2021年12月臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌共152株(剔除重復(fù)株，同一患者只留取首次分離株)，其中CRABA 86株，對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物敏感的鮑曼不動(dòng)桿菌(CSABA)有66株。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司)，凝膠成像儀(美國(guó)Bio-rad公司)，2720Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)，DYY-2C型水平電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2.2主要試劑 哥倫比亞血平板、MH瓊脂平板購(gòu)自廣州市迪景微生物科技有限公司，替加環(huán)素藥敏緩沖液購(gòu)自珠海迪爾生物有限公司，外排泵基因及外膜孔蛋白carO基因引物(表1)、DNA Marker、Premix溶液等PCR實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC25922)，銅綠假單胞菌(ATCC27853)均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

表1 靶基因PCR擴(kuò)增引物及產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3方法

1.3.1收集CRABA菌株來(lái)源患者的臨床資料 收集CRABA菌株來(lái)源患者的一般資料，包括性別、年齡，菌株來(lái)源科室、標(biāo)本等。

1.3.2藥物敏感試驗(yàn) 嚴(yán)格按照2020年CLSI-M100第30版[2]推薦的方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用VITEK-2全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析儀檢測(cè)細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)，紙片擴(kuò)散法(K-B法)檢測(cè)細(xì)菌的抑菌圈直徑。對(duì)于替加環(huán)素K-B法的藥敏折點(diǎn)，參照美國(guó)FDA的藥敏標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[3]。頭孢哌酮/舒巴坦的藥敏折點(diǎn)參照頭孢哌酮的藥敏標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀[4]。

1.3.3基因檢測(cè) 挑取新鮮菌落，采用加熱煮沸法制備細(xì)菌DNA模板，PCR擴(kuò)增6種外排泵基因(ade B、ade R、ade S、ade J、abe M)和外膜孔蛋白carO基因(外排泵基因反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。carO基因反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 60 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠、120 V電泳約25 min，通過(guò)凝膠成像儀獲取圖像及進(jìn)行分析。

1.3.4基因測(cè)序 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行純化及測(cè)序，結(jié)果在NCBI上經(jīng)BALST比對(duì)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用WHONET 5.6軟件對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抗菌藥物敏感性進(jìn)行描述性分析，計(jì)數(shù)資料用百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CRABA菌株來(lái)源患者的臨床資料 86株CRABA臨床菌株來(lái)源患者的年齡為7 d至99歲，其中男性患者56例，女性患者30例，男女比例為1.87∶1。86株CRABA菌株主要分布于重癥監(jiān)護(hù)室48株(55.8%)，神經(jīng)外科11株(12.8%)，神經(jīng)內(nèi)科8株(9.3%)，胸心外科6株(7.0%)，呼吸內(nèi)科5株(5.8%)，內(nèi)分泌科2株(2.3%)，骨科、婦科、口腔科、感染科、手外科以及腫瘤科各1株。86株CRABA菌株來(lái)源標(biāo)本的類(lèi)型以呼吸道標(biāo)本為主，占86.0%；其次為傷口分泌物，占7.0%；血液標(biāo)本占3.5%；尿液標(biāo)本占2.3%；膿液標(biāo)本占1.2%。

2.2藥物敏感試驗(yàn) 對(duì)152株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行14種抗菌藥物的體外敏感試驗(yàn)(表2)，其中CRABA對(duì)抗菌藥物的耐藥性明顯高于CSABA，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中有4株CRABA菌株對(duì)替加環(huán)素耐藥，耐藥率為5.6%；CRABA對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率為24.4%，對(duì)米諾環(huán)素的耐藥率為58.0%，對(duì)其余抗菌藥物的耐藥率均高于70%。

表2 152株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥率

2.3外排泵基因的檢測(cè) 152株鮑曼不動(dòng)桿菌中，分別檢出ade B 122株、ade R 104株、ade S 114株、ade J 138株、abe M 146株，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，見(jiàn)圖1。86株CRABA菌株中ade B(95.3%，82/86)、ade R(80.2%，69/86)、ade S(94.2%，81/86)以及ade J(96.5%，83/86)的檢出率明顯高于66株CSABA菌株中ade B(60.6%，40/66)、ade R(53.0%，35/66)、ade S(50.0%，33/66)以及ade J(83.3%，55/66)的檢出率，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；abe M基因在CRABA與CSABA菌株中的檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

注：M為DNA Marker；1～2為ade B外排泵基因(541 bp)；3～4為ade R外排泵基因(447 bp)；5～6為ade S外排泵基因(544 bp)；7～8為ade J外排泵基因(463 bp)；9～10為abe M外排泵基因(703 bp)。

2.4外膜孔蛋白carO基因的檢測(cè) 152株鮑曼不動(dòng)桿菌中，共檢出carO基因135株，檢出率為88.8%，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，見(jiàn)圖2。其中carO基因在CRABA菌株的檢出率(95.3%)明顯高于CSABA菌株(80.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

注：M為DNA Marker；11～16為carO基因(750 bp)。

表3 CRABA和CSABA菌株外膜孔蛋白carO基因及外排泵基因檢出率比較[n(%)]

3 討 論

鮑曼不動(dòng)桿菌可引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎和血流感染，具有很高的發(fā)病率及病死率，尤其是CRABA的出現(xiàn)和傳播，給臨床的抗感染治療帶來(lái)重大挑戰(zhàn)。由于鮑曼不動(dòng)桿菌是醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原體，對(duì)其菌株進(jìn)行流行病學(xué)以及相關(guān)耐藥機(jī)制的研究十分必要。本研究對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的臨床數(shù)據(jù)以及耐藥性分析顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌的分離株主要存在于重癥監(jiān)護(hù)室、神經(jīng)外科以及神經(jīng)內(nèi)科，常見(jiàn)于長(zhǎng)期臥床、有侵入性操作史和免疫功能低下的患者。CRABA菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥性明顯高于CSABA。其中CRABA菌株對(duì)替加環(huán)素的耐藥率最低(5.6%)，頭孢哌酮/舒巴坦(24.4%)以及米諾環(huán)素(58.0%)次之，對(duì)其他抗菌藥物的耐藥率均高于70%，該結(jié)果與2020年CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)較一致[1]。抗菌藥物的持續(xù)過(guò)度使用導(dǎo)致鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性增強(qiáng)，其原因可能是通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得了各種抗菌藥物抗性基因[5]或其他因素[6]導(dǎo)致，包括膜通透性降低、抗菌藥物靶位的改變、水解酶的產(chǎn)生、外排泵的過(guò)度表達(dá)以及生物膜的形成等。在所有耐藥機(jī)制的研究中，外排泵因其廣泛的底物特異性和在不同細(xì)菌中的廣泛分布而成為重要的耐藥決定因素之一。

鮑曼不動(dòng)桿菌的基因組富含藥物主動(dòng)外排泵基因，其外排泵對(duì)多種底物表現(xiàn)出特異性，例如抗菌藥物、去污劑、殺菌劑以及染料等，除此以外還可排出具有不同生理功能的關(guān)鍵分子，其中最常見(jiàn)的是耐藥結(jié)節(jié)分化家族，主要介導(dǎo)鮑曼不動(dòng)桿菌的固有耐藥以及獲得性耐藥。本研究表明Ade ABC、Ade IJK、Abe M外排泵及調(diào)控基因(ade R、ade S)廣泛分布于臨床鮑曼不動(dòng)桿菌分離株中，CRABA菌株各基因的檢出率在80%～98%，CSABA菌株各基因的檢出率在50%～92%，與BADWY等[7]研究結(jié)果相似。在CRABA菌株中ade B基因的檢出率高達(dá)95.3%，與CSABA菌株的檢出率(60.6%)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明ade B基因是Ade ABC外排泵產(chǎn)生耐藥的主要因素[8-9]。Ade ABC外排泵的表達(dá)受上游雙組分調(diào)控系統(tǒng)Ade RS控制，Ade RS通過(guò)堿基的突變可引起Ade ABC外排泵的過(guò)度表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)CRABA菌株中ade R及ade S基因的檢出率明顯高于CSABA菌株，進(jìn)一步推測(cè)在CRABA菌株中Ade RS控制系統(tǒng)更容易引起Ade ABC外排泵的高表達(dá)，從而導(dǎo)致菌株耐藥性的增高。Ade IJK外排泵主要與Ade ABC外排泵組成復(fù)合體結(jié)構(gòu)，對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒素作用，Ade J外排泵與Ade B外排泵具有協(xié)同效果，Ade J外排泵可利用四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物的疏水特性進(jìn)行識(shí)別，可能成為耐替加環(huán)素鮑曼不動(dòng)桿菌的優(yōu)勢(shì)基因[10-11]。本研究中ade J基因檢出率在CRABA與CSABA菌株間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中4株對(duì)替加環(huán)素耐藥的CRABA菌株均檢出ade J和ade B基因。MATE家族中的Abe M外排泵以H+驅(qū)動(dòng)力作為主要能量，程建軍等[10]研究表明abe M基因的高表達(dá)與鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥密切相關(guān)，BRATU 等[12]研究指出 abe M基因?qū)︴U曼不動(dòng)桿菌菌株多重耐藥性的參與較弱。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)abe M基因檢出率在CRABA菌株與CSABA菌株間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的耐藥無(wú)關(guān)，而ade B、ade R、ade S以及ade J基因的檢出率在CRABA與CSABA菌株間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示本地區(qū)CRABA的耐藥性與AdeABC及Ade IJK外排泵密切相關(guān)。

在鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白中，carO是僅次于OmpA的第二豐富蛋白質(zhì)，可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)影響鮑曼不動(dòng)桿菌在宿主細(xì)胞中的黏附和毒力[13],同時(shí)carO蛋白參與了亞胺培南、鳥(niǎo)氨酸在鮑曼不動(dòng)桿菌外膜中的選擇性滲透[14]，因此當(dāng)它發(fā)生丟失或突變時(shí)，與碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的獲得性耐藥存在一定聯(lián)系[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，carO基因的檢出率在CRABA與CSABA菌株間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，carO基因在CRABA菌株中更容易檢出。該結(jié)果與ABBASI等[16]研究相符，但與潘紅超等[17]的研究不同，可能是由于多種carO 多態(tài)性變體共存于對(duì)亞胺培南具有不同特異性的鮑曼不動(dòng)桿菌種群中所引起，因此還需要對(duì)carO蛋白的mRNA做定量分析，有助于了解carO蛋白在不同鮑曼不動(dòng)桿菌中的表達(dá)。

綜上所述，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，不同耐藥機(jī)制之間交錯(cuò)聯(lián)系，外膜孔蛋白以及外排泵系統(tǒng)是本地區(qū)CRABA的主要耐藥機(jī)制之一，其中abe M基因可能與CRABA菌株耐藥性無(wú)關(guān)。本研究的不足之處在于沒(méi)有對(duì)外排泵基因及外膜孔蛋白基因的表達(dá)做定量分析，將在以后的研究中補(bǔ)充，以期進(jìn)一步明確鮑曼不動(dòng)桿菌的相關(guān)耐藥機(jī)制。