兩種國產化學發光系統檢測HBsAg和HBeAg的效果分析*

譚延國，王紀越，張然星，田 野，劉 晴，王曉寧，古 媛，聶秋燕,李卓敏，于 洋

1.首都醫科大學附屬復興醫院檢驗科，北京 100038；2.首都醫科大學醫學檢驗系，北京 100038；3.中國中醫科學院眼科醫院，北京 100040

乙型肝炎病毒(HBV)血清標志物檢測是入院或術前檢查的常規內容，對于及時發現、及早治療、阻斷HBV感染以及防止其傳播意義重大。我國曾廣泛使用酶聯免疫吸附測定、放射免疫法、板式化學發光法等檢測上述項目，而微粒子或電化學發光等方法的效能則更具優勢[1]。現進口化學發光系統仍為主流檢測方法，如雅培、西門子、羅氏、貝克曼、希森美康等品牌[2]。近年來，隨著國產化學發光檢測系統的日臻成熟[3]，其在成本控制、人機交互等方面都有著較進口化學發光系統更為明顯的優勢，雖然不乏對檢測系統間性能比對的臨床研究，但對本研究中評估的兩個國產檢測系統性能進行比對的文獻仍少見，其定性與定量檢測性能尚未被深入了解與認知。本研究以行業認可度較高的進口檢測系統作參照，對國產檢測系統乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)定性、定量結果的一致性進行評估，進而為其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1標本來源 實驗使用的血清均來自復興醫院使用ARCHITECT?SYSTEM i2000SR系統常規檢測患者HBsAg和(或)HBeAg結果為陽性(復測后仍為陽性)或陰性的靜脈血標本[每例標本同時還檢測了乙型肝炎病毒表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)等HBV血清標志物]。標本采集時間為2019年6月至2022年4月，均無黃疸、溶血和脂血。其中HBsAg標本共492例(陽性292例，陰性200例)，男257例、女235例，年齡18～85歲；HBeAg標本464例(陽性250例，陰性214例)，男243例、女221例，年齡19～83歲。均使用含惰性分離膠及促凝劑的真空采血管采集，4 000 r/min離心10 min，常規檢測完畢后，分離剩余血清，儲存于-80 ℃冰箱待用。本研究已在復興醫院倫理委員會備案。

1.2儀器與試劑 檢測系統分別為美國雅培公司的ARCHITECT?SYSTEM i2000SR(以下簡稱S1)、邁克生物股份有限公司的Maccura i3000(以下簡稱S2)、邁瑞生物醫療電子股份有限公司的Mindray CL6000i全自動微粒子化學發光分析儀(以下簡稱S3)及配套試劑、定標品、質控品、輔助試劑及耗材。幾個系統的檢測原理均為基于雙抗體夾心法的微粒子化學發光法。

1.3方法 所有設備均按要求進行維護、保養和校準；實驗操作均按說明書進行，室內質控在控時方進行標本的檢測。

標本從冰箱中取出，恢復至室溫后均使用2個國產化學發光免疫分析系統S2和S3復測(每個標本同時用3種方法檢測)，進一步分析幾個系統間定量和定性結果的符合性。對于3個系統有任意2個結果不符的標本及高于HBsAg檢測上限(≥250 IU/mL)的標本，將再次使用S1檢測1次(≥250 IU/mL的標本稀釋后檢測)。

定量數據偏倚的計算：(S2或S3-S1)/S1×100%。各檢測系統HBsAg測定均為全定量方法；對HBeAg而言，S2為全定量檢測(可溯源至國際標準物質)，S1和S3均為定性檢測。各系統具體特征如表1所示。

表1 各系統測定HBsAg和HBeAg的方法學特點

1.4統計學處理 使用IBM SPSS23.0對實驗數據做統計學處理。非正態分布的定量數據以M(P25,P75)表示，數據之間比較采用配對秩和檢驗;采用Spearman相關分析S1與S2、S3檢測結果間的相關性；定性數據比較采用配對χ2檢驗；一致性分析采用Kappa一致性檢驗。對于S1檢測HBsAg<1.00 IU/mL結果的標本，采用受試者工作特征(ROC)曲線分別分析S1與S2、S3檢測結果的最佳臨界值。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HBsAg的檢測結果分析

2.1.1HBsAg定性結果的總體符合性分析 S2、S3對HBsAg的定性結果與S1的定性總符合率均為97.76%、陽性符合率均為96.58%、陰性符合率均為99.50%，定性結果一致檢驗均為Kappa值=0.954(P<0.001)； S2、S3分別與S1相比，對HBsAg的定性結果差異均有統計學意義(均P=0.012)。見表2、3。

表2 S1、S2檢測HBsAg定性結果的符合性分析(n)

表3 S1、S3檢測HBsAg定性結果的符合性分析(n)

2.1.2不同HBsAg定量區間各系統HBsAg定性結果的符合性分析 根據S1檢測HBsAg的定量結果，劃分了若干HBsAg定量水平區間，以進一步分析S2和S3檢測HBsAg的定性結果與S1結果的符合情況。如表4所示，當S1檢測的HBsAg≥1.00 IU/mL時，S2和S3檢測HBsAg的結果與S1檢測結果的定性符合率均為100.00%；而當S1檢測的HBsAg處于0.50～<1.00、0.05～<0.50 IU/mL時，S2和S3檢測HBsAg的結果與S1檢測結果的定性符合率則均分別為91.67%和70.97%。

表4 不同HBsAg定量區間各系統HBsAg定性結果的符合性分析

S1檢測HBsAg<1.00 IU/mL的所有標本，結合S2和S3結果繪制ROC曲線。結果顯示，當S1檢測的HBsAg <0.21 IU/mL時，S2檢測HBsAg結果為陰性的比例為63.63%[曲線下面積(AUC)=0.829,P=0.002]；當S1檢測的HBsAg<0.18 IU/mL時，S3檢測HBsAg結果為陰性的比例為70.00%(AUC=0.820,P=0.002)。

2.1.3不同檢測系統間HBsAg定量水平的符合性分析 如表5所示，在S1檢測HBsAg的不同定量水平區間內，分析了S1檢測的HBsAg定量結果與S2和S3檢測結果的相關性，計算了S1檢測結果與S2和S3檢測結果的相對偏差。結果表明，除HBsAg定量水平在0.50～<1.00 IU/mL，S3檢測的HBsAg定量結果與S1之間無相關性(P>0.05)，以及HBsAg水平在100.00～<250.00 IU/mL，S2檢測的HBsAg定量結果與S1之間無相關性(P>0.05)外，在其他的HBsAg定量區間，S2、S3檢測的HBsAg結果與S1的結果均相關(P<0.05)。配對秩和檢驗顯示，在所有的HBsAg定量區間，S2檢測的HBsAg定量水平均明顯低于S1(P<0.05)；而對于S3而言，除在0.50～<1.00 IU/mL和100.00～<250.00 IU/mL HBsAg定量區間，S3檢測的HBsAg定量水平與S1差異無統計學意義(P=0.071、0.873)外，在其余的HBsAg定量區間，S3檢測的HBsAg定量水平均明顯低于S1(P<0.05)。S2檢測HBsAg的定量水平與S1檢測結果的相對偏倚為-59.03%～-45.82%，S3檢測HBsAg的定量水平與S1檢測結果的相對偏倚為-71.05%～-33.75%。

表5 根據S1的HBsAg定量結果劃分區間后，各系統定量結果的統計學描述、相關性和差異性比較

S1檢測HBsAg的不同定量區間(IU/mL)n與S1的平均偏倚(%)S2S3與S1的配對秩和檢驗[Z(P)]S2S30.05～<0.5031-59.03-52.60-3.842(<0.001)-4.529(<0.001)0.50～<1.0012-55.92-50.00-3.059(0.002) -1.804(0.071)1.00～<10.0061-58.15-47.53-5.473(<0.001)-5.240(<0.001)10.00～<100.0085-49.31-46.02-5.054(<0.001)-2.522(0.012)100.00～<250.0051-45.82-33.75-4.274(<0.001)-0.159(0.873)≥250.0052-47.59-71.05-3.634(<0.001)-6.275(<0.001)

2.1.4對任意2個系統HBsAg定性結果不符合標本的進一步分析 如表6所示，任意2個檢測系統間HBsAg定性結果不符合的共15例。這些標本除55號和128號標本外，其余13例標本均為使用S1(只作為參照系統，而非金標準方法)檢測HBsAg為陽性的標本，這13例標本其他HBV標志物的常規檢測結果顯示均為“小三陽”(HBsAg+、HBcAb+、HBeAb+)；而僅S2或S3檢測HBsAg陽性的2例標本(55號和128號)，則僅為HBsAg呈單獨陽性。

表6 任意2個檢測系統間HBsAg定性結果(+/-)不符合標本列表

2.2各系統檢測HBeAg的定性結果分析 S3檢測HBeAg的定性結果與S1檢測結果的總體符合率、陽性符合率、陰性符合率分別為96.77%、99.20%、93.93%，一致性檢驗Kappa值=0.936(P<0.001)；S2檢測HBeAg的定性結果與S1檢測結果的總體符合率、陽性符合率、陰性符合率分別為97.84%、98.40%、97.20%，一致性檢驗Kappa值=0.957(P<0.001)。S3檢測HBeAg的定性結果與S1差異有統計學意義(P=0.007)；S2檢測HBeAg的定性結果與S1差異無統計學意義(P=0.754)。見表7、8。

表7 S1、S2檢測HBeAg定性結果的符合性分析(n)

如表9所示，任意2個檢測系統間HBeAg定性結果不符合的共19例，這些標本在留取標本凍存前、使用S1檢測5項HBV血清標志物時，除了86號外(S1、S2檢測5項HBV血清標志物結果均為陰性，僅S3檢測的HBeAg為單獨陽性)，其余標本檢測結果均為“大三陽”(HBsAg+、HBeAg+、HBcAb+)，只是有些臨界值附近標本在凍存一段時間后，再次測定時，部分標本S1、S2檢測HBeAg的陽性率明顯下降，但S3可能受標本保存時間的影響較小，多數標本仍為陽性，具體原因仍待探討。

表8 S1、S3檢測HBeAg定性結果的符合性分析(n)

表9 任意2個檢測系統間HBeAg定性(+/-)結果不符合者列表

3 討 論

HBsAg是HBV感染后第一個出現的標志物，一旦確定HBsAg陽性，即可明確為HBV感染[4-6]。HBeAg陽性是HBV復制以及傳染性強的標志物，高水平HBeAg與HBV DNA關系更為密切[7-8]。故對二者的準確檢測十分必要。

目前，雖然關于方法學比對的研究較多，但對本研究探討的檢測系統而言，尚未見使用S2評估HBsAg和(或)HBeAg的相關文獻，也僅見1篇文獻評估了使用S3檢測HBsAg的研究[9]，但鮮見從定性、定量、定性結果符合情況以及對不符合標本進行深入分析的相關文獻。

本研究顯示，2個國產化學發光免疫分析系統檢測HBsAg和HBeAg，與進口化學發光免疫分析系統均具有非常高的陽性、陰性符合率，顯示國產化學發光檢測系統測定HBV血清標志物已有了長足進步[9]，其性能已可滿足大規模應用于常規檢測的需要。

就定性結果而言，對于S1檢測結果HBsAg≥1.00 IU/mL的標本，S2和S3均可100%檢出；對于15例任意2個系統檢測不符的標本，其HBsAg定量值均<1.00 IU/mL,由于其中有13例HBV血清標志物檢測皆為“小三陽”，故其HBsAg真陽性的可能性大。而國產化學發光免疫分析系統各檢測出3例陽性。ROC曲線顯示，當S1檢測HBsAg的定量結果<0.21 IU/mL時，S2檢測HBsAg陰性的概率為63.63%，而當S1檢測HBsAg的定量結果<0.18 IU/mL時，S3檢測HBsAg陰性的概率為70.00%。故國產化學發光免疫分析檢測系統在低水平HBsAg的檢出能力上可能尚待提高。而在臨床實際工作中，HBsAg<1.00 IU/mL的HBV感染者占比很少。本研究也發現了2例S1檢測HBsAg結果為陰性，而S2或S3檢測HBsAg陽性且均為低值的標本(分別為0.05 IU/mL和0.12 IU/mL)，且3個系統檢測HBsAb、HBeAg、HBcAb、HBeAb結果均為陰性，故有理由認為此2例標本S2和S3 HBsAg假陽性的可能大。本研究未做HBsAg的確認試驗和HBV-DNA的檢測(即金標準方法)，因為確認試驗的靈敏度普遍偏低，且即使HBV-DNA陰性也不能排除HBsAg陽性的可能。由于本研究這方面設計的不足，也提示對于進口試劑陽性、兩種國產試劑陰性的標本，也存在真陰性的可能。

除了檢測下限，檢測出HBsAg變異株的能力也是檢測系統的重要性能指標之一，如HBsAg、HBsAb雙陽性的標本[10-13]，此類標本在本研究中也有2例(0.68%)。這方面的性能，尚需長期的臨床實踐驗證。

對于HBV引起的乙型肝炎患者，HBsAg定量雖然與病毒載量的關系不如HBeAg密切，但同樣可反映病毒水平[14-15]，故準確定量檢測HBsAg也非常重要。本研究顯示，兩個國產化學發光免疫分析系統S2、S3檢測HBsAg的定量水平與進口化學發光免疫分析系統S1存在中等程度的相關性，但相關程度隨其定量水平的區間變動，且相對于進口系統的負偏倚較大，在各個HBsAg定量水平區間，S2、S3檢測結果與S1的偏倚基本都在-50%左右。這提示，如要根據HBsAg定量水平預測HBV拷貝數，最好使用同一檢測系統進行監測，如果數據來自不同檢測系統，則判斷結果時應非常慎重。對于HBsAg為何定量試驗存在如此大偏差的原因，仍不明確。本研究雖然使用了凍存標本，但由于保存條件為-80 ℃，標本質量還是有保障的；且對于這些任意2個系統檢測HBsAg定性結果不符的標本也使用S1進行了復測，顯示至少對這些弱陽性標本而言，新鮮標本與復測標本前后定量水平差異是非常小的，凍存后復測仍為陽性；對于HBsAg≥250.00 IU/mL標本，也用S1稀釋后進行了復測，且S2、S3定量水平與S1間的偏倚仍與HBsAg其他定量區間的偏倚基本吻合。

對于HBeAg，S2的檢出率與S1更為接近，可能同樣受標本保存時間的影響。這提示對于HBeAg而言，即便是-80 ℃冰箱凍存，其臨界值附近的結果也可能會受到影響。但實際工作中，HBV血清標志物檢測為常規檢測項目，基本當日即完成檢測，可忽略這種儲存因素的影響。