MALDI-TOF MS技術直接鑒定無菌體液病原菌的效果評價*

張鞠玲,康 琳,鮑春梅,王 歡,賈天野 ,陳素明,龐君麗,李伯安△

1.解放軍總醫院第五醫學中心檢驗科，北京 100039;2.軍事科學院軍事醫學研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

膿毒癥是機體對感染反應失調進而引發器官功能障礙、危及生命的疾病[1]。膿毒癥發生率高，全球每年有超過1 900萬嚴重膿毒癥病例，美國每年有75萬膿毒癥患者，造成超過 21萬人死亡，是危重患者死亡的主要原因[2]。在臨床 ICU，血液感染所致膿毒癥的發生率可達到95%，病死率約為26%；腹腔感染所致膿毒癥的發生率可達到 40%，病死率約為 36%[3-4]。及時識別病原菌并使用適當的抗菌藥物治療可顯著降低膿毒癥病死率[5-6]?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是近年來關注度較高的鑒定技術，通過采集待檢標本中的生物標志物蛋白，得到目標生物的蛋白指紋質譜圖，與數據庫中標準質譜圖進行比對，從而鑒定細菌、真菌及分枝桿菌等，該方法具有快速、準確、高通量、重復性好、靈敏度高等優點[7-8]。本研究將血液和腹水陽性培養瓶中的病原菌富集后，應用MALDI-TOF MS進行直接鑒定，與傳統培養法比較菌種鑒定結果的準確性，探討此方法在膿毒癥診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1標本來源 連續收集2021年6-10月解放軍總醫院第五醫學中心檢驗科血液、腹水培養報警陽性的標本共418份(包括需氧瓶和厭氧瓶)。其中血培養陽性標本220份，腹水培養陽性標本198份；單菌株感染培養瓶410份，混合感染培養瓶8份。單菌株感染中革蘭陰性菌244 株，革蘭陽性菌149 株，真菌17株。對于同一患者不同部位感染的普通和厭氧培養瓶也同時納入本研究中。

1.2儀器與試劑 血平皿(英國Oxoid公司)、中國藍平皿(Oxoid公司，英國)、沙保弱平皿(英國Oxoid公司)、1.5 mL離心管(美國Axygen公司)、α-氫基-4-羥基肉桂酸即HCCA(德國Bruker公司)、無水乙醇、乙腈及甲酸(美國Fisher Scientific公司)，溶血劑(邁瑞南京生物技術有限公司)?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀Microflex LT(德國Bruker公司),VITEK-2全自動微生物鑒定及藥敏分析儀(法國梅里埃生物股份有限公司)，電熱恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)，高速離心機(美國Thermo公司)，BACT/ALERT 3D 240全自動血液培養儀(法國梅里埃生物股份有限公司)。

1.3方法

1.3.1MALDI-TOF MS檢測

1.3.1.1標本的前處理 (1)含有血細胞陽性瓶的前處理：用5 mL無菌注射器從血陽性培養瓶中吸取2 mL液體至空白管中，15 000 r/min離心3 min，吸取200 μL上清液于EP管中，加入100 μL溶血劑振蕩混勻30 s，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液，再加入700 μL蒸餾水振蕩混勻30 s，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液備用。(2)不含血細胞陽性瓶的前處理：從培養瓶中吸取500 μL帶菌液體于EP管中，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液，加入700 μL蒸餾水振蕩混勻30 s，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液。(3)菌液富集：向留有沉淀的EP管中加入300 μL蒸餾水和900 μL無水乙醇振蕩混勻30 s，將混合物12 000 r/min離心3 min吸去上清液，加入50 μL 70%甲酸，再加入50 μL乙腈，振蕩混勻30 s，12 000 r/min離心2 min，得到上清液待用。

1.3.1.2MALDI-TOF MS鑒定 取1 μL上清液點在MALDI靶板上，干燥后表面加入1 μL基質，再次室溫干燥后將靶板放入質譜儀中進行蛋白質指紋圖譜的采集。使用MALDI Biotyper 3.0軟件進行數據分析和比對得出鑒定結果。每株菌點2個靶點進行平行檢測，取最高評分計入數據統計。

1.3.1.3MALDI-TOF MS 結果判讀 MALDI-TOF MS系統鑒定分值>2.0為菌株鑒定結果到種水平可信；分值在1.7～2.0為菌株鑒定結果到屬水平可信，重新檢測或補充實驗幫助鑒定；分值<1.7結果不可信。

1.3.2病原菌培養與生化鑒定 血培養儀陽性瓶報警后，經涂片、革蘭染色、鏡檢、轉種血平皿、中國藍平皿或厭氧平板，培養24～48 h，挑取純菌落，選取合適的鑒定卡用VITEK-2鑒定并記錄結果。VITEK-2鑒定結果同MALDI-TOF MS直接鑒定結果不同的菌株，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行PCR測序。

1.3.3質量控制 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀Microflex LT和VITEK-2全自動微生物鑒定及藥敏分析儀均使用大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、白色念珠菌ATCC14053和肺炎鏈球菌ATCC49619作為質控菌株，菌株購自美國模式培養物集存庫。

1.4統計學處理 采用SPSS25.0軟件進行數據處理，計數資料以頻數或百分率表示,比較采用χ2檢驗和Fisher檢驗。比較MALDI-TOF MS與VITEK-2菌株鑒定的準確率。準確率=準確鑒定菌株數/菌株總數×100%。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MALDI-TOF MS單一病原菌的直接鑒定 410份單菌株感染所致的陽性標本中，MALDI-TOF MS 直接鑒定準確率為98.54%(404/410)，VITEK-2鑒定的準確率為98.54%(404/410)，兩者比較差異無統計學意義(χ2=0.085，P>0.05)。革蘭陰性菌MALDI-TOF MS 直接鑒定的準確率為99.59%(243/244)，VITEK-2鑒定的準確率為98.77%(241/244),兩者比較差異無統計學意義(χ2=0.252，P>0.05)。革蘭陽性球菌MALDI-TOF MS鑒定的準確率為97.32%(145/149)，VITEK-2鑒定的準確率為99.33%(148/149)，兩者比較差異無統計學意義(χ2=0.814，P>0.05)。17株真菌MALDI-TOF MS 直接鑒定的準確率為94.12%(16/17)，VITEK-2鑒定的準確率為88.24%(15/17),兩者比較差異無統計學意義(P=0.5)。見表1。MALDI-TOF MS和VITEK-2鑒定結果不同的單菌株共12株，經分子生物學方法確認，MALDI-TOF MS鑒定準確6株，準確率為50.00%(6/12)。見表2。

表1 單菌株感染MALDI-TOF MS和VITEK-2鑒定結果

續表1 單菌株感染MALDI-TOF MS和VITEK-2鑒定結果

表2 兩種方法鑒定結果不同的單菌株分子生物學方法鑒定情況分析

續表2 兩種方法鑒定結果不同的單菌株分子生物學方法鑒定情況分析

2.2MALDI-TOF MS直接鑒定分值分布 MALDI-TOF MS直接鑒定，410株單菌株鑒定分值>1.7即鑒定至屬水平占93.17%(382/410)，分值>2.0即鑒定至種水平占82.68%(339/410)。其中革蘭陰性菌中屬、種水平鑒定率分別為97.54%(238/244)、89.34%(218/244),革蘭陽性球菌中屬、種水平鑒定率分別為87.92%(131/149)、74.50%(111/149),真菌中屬、種水平鑒定率分別為76.47%(13/17)、58.82%(10/17)。革蘭陰性菌中鑒定分值<1.7的共6株，其中5株結果正確(腸炎沙門菌1株、嗜麥芽窄食單胞菌2株、黏質沙雷菌2株)，1株產酸克雷伯菌鑒定不正確。革蘭陽性球菌中鑒定分值<1.7的共18株，其中14株結果正確(頭狀葡萄球菌2株、肺炎鏈球菌2株、副血鏈球菌1株、唾液鏈球菌4株、星座鏈球菌3株、停乳鏈球菌2株)，4株未鑒定出結果(唾液鏈球菌2株、緩癥鏈球菌2株)。真菌中鑒定分值<1.7的共4株，其中2株薩希毛孢子菌、1株葡萄牙假絲酵母菌鑒定分值<1.7，但結果正確，而1株新型隱球菌MALDI-TOF MS未鑒定出結果。復合菌株中屬、種水平鑒定率分別為75.00%(6/8)、25.00%(2/8)，2株復合菌鑒定分值<1.7,但是結果正確。見表3。

表3 418份陽性標本MALDI-TOF MS直接鑒定分值分布(n)

2.3時間比較 MALDI-TOF MS從陽性培養瓶報警、卸載、提取菌液到鑒定出結果需要30 min，VITEK-2從陽性培養瓶報警、卸載、標本接種、培養、挑取純菌落上機到鑒定出結果需要24～48 h，分子生物學方法經測序鑒定需要 24～48 h。

3 討 論

膿毒癥發病機制復雜，涉及全身多個系統，發病率和病死率居高不下。病程早期難以察覺，常缺乏指向性的臨床表現，容易被誤診成局部病灶感染，進而發展成膿毒性休克，識別致病菌并合理選用抗菌藥物是膿毒癥個體化診斷和精準治療的關鍵[9-10]。MALDI-TOF MS在微生物病原菌的快速鑒定中發揮著越來越重要的作用[11-12]，目前已報道的MALDI-TOF MS直接鑒定的標本種類包括血、腦脊液、尿等[13-14]，鮮見直接鑒定腹水標本的相關報道。本研究中，腹水和血液培養陽性標本預處理后經MALDI-TOF MS直接鑒定準確度高，可為快速診斷由腹水和血液感染所致的膿毒癥帶來極大的便利。

利用質譜技術直接分析臨床標本，其前處理方法至關重要。本研究通過裂解破壞宿主細胞，再經離心收集菌體進行鑒定，溶血劑嘗試選擇實驗室血常規儀器配套試劑，無需其他試劑及耗材，與傳統生化VITEK-2鑒定方法相比，鑒定符合率高，與王林等[15]研究結果相同。Bruker Sepsistyper試劑盒對革蘭陰性菌和革蘭陽性球菌的鑒定率接近但略低于LIN方法[16-17]，但試劑盒成本高且部分試劑采購受限，目前不適合在臨床實驗室廣泛推廣。本研究顯示，MALDI-TOF MS直接鑒定革蘭陰性菌屬、種的準確率最高，其次是革蘭陽性球菌、真菌，與張浩然等[18]報道相同。本研究中，1株產酸克雷伯菌鑒定不準確，這可能與表層黏液影響有效菌體蛋白的獲取有關。鏈球菌鑒定分值普遍較低，這可能與鏈球菌生長緩慢，細菌富集量相對較少，細胞壁較厚增加其抗溶解性有關，同時溶解后的血細胞成分也對結果產生了干擾[19]。新型隱球菌未鑒定出結果，可能與隱球菌細胞壁過厚不易破壞，且離心獲得菌量不足導致未獲得足夠的菌體蛋白譜峰，無法完成質譜分析有關。MALDI-TOF MS可將兩種菌分開鑒定，本研究中復合菌屬鑒定率達75.00%，與侯偉偉等[20]報道基本一致。通過對現有鑒定方法用時比較，發現VITEK-2鑒定單菌株需24～48 h，MALDI-TOF MS對單菌株鑒定耗時約 30 min且可多菌株同時檢測，用時最短、操作簡便，實驗室人員經過培訓可獨立完成，人為誤差較小。

綜上所述，本研究利用MALDI-TOF MS對血和腹水培養瓶標本進行快速直接鑒定，與傳統菌落培養鑒定方法相比較，鑒定準確度高、快速、高效、成本低廉且實用性強，可為膿毒癥病原菌的鑒定提供有效、可行的實驗室檢測手段，適合在臨床微生物實驗室中進行推廣。