蕓薹子對母鼠及其子鼠生產(chǎn)性能和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

張 巍， 嚴念東， 黃東海， 樊啟文， 魏金濤*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細菌病防治劑創(chuàng)制重點實驗室/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院中藥材研究所，湖北恩施 445000）

圍產(chǎn)期機體因處于高速分解代謝狀態(tài)，會產(chǎn)生大量自由基，是乳腺炎、子宮炎高發(fā)期（殷曉風，2016；林森，2014）。目前圍產(chǎn)期炎癥治療方案多使用抗生素，但抗生素一方面會影響畜產(chǎn)品品質(zhì)，另一方面也會影響幼崽腸道菌群結(jié)構(gòu)從而影響健康，且會產(chǎn)生環(huán)境污染、藥物殘留、細菌耐藥性等問題，我國已于2020年7月1日起，飼料企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑的商品飼料，但中草藥類除外。我國應用中草藥作為飼料添加劑歷史悠久，因其具有來源天然、功能多樣、安全可靠、經(jīng)濟環(huán)保等特點，將取代抗生素占據(jù)“無抗”市場。

古籍記載蕓薹子為白菜型油菜成熟種子（荊文光，2014），白菜型油菜因抗病力弱、產(chǎn)量低、芥酸含量高，農(nóng)業(yè)種植上已基本淘汰，現(xiàn)種植品種主要為低芥酸、低硫苷的“雙低”品種（杜海等，2011）。現(xiàn)代蕓薹子除含較低的芥酸和硫苷外，還含有較高的油酸（61%）、亞油酸（21%）、α-亞麻酸（11%）以及植物甾醇和生育酚等成分（Anna Lewinska等，2015），其中n-6多不飽和脂肪酸∶n-3多不飽和脂肪酸的比值為2.84（黃玉華和鄧澤元，2007）。研究發(fā)現(xiàn)，油酸可有效緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應激（李萍等，2012）、調(diào)節(jié)脂類代謝、提高體內(nèi)抗氧化能力（張佰帥等，2012；李萍等，2011），且可影響脂肪細胞分化過程中脂滴及甘油三酯的形成（金鑫等，2020）。泌乳母豬飼糧中補充一定量富含油酸的橄欖油可顯著降低仔豬泌乳期死亡率，提高初乳和常乳乳脂含量，降低乳汁和仔豬血漿中炎癥因子濃度（申勇，2015）；補充一定量“雙低”熟化油菜籽能顯著提高初乳和常乳中固形物和乳脂含量，提高仔豬窩重和平均窩日增重（唐春艷，2015；郭萬正等，2014）；而n-3多不飽和脂肪酸不僅可調(diào)節(jié)母體腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)，還可以通過泌乳階段母體日糧持續(xù)調(diào)節(jié)腸道微生物群來影響后代（Robertson等，2018），不同比例的n-6：n-3能有效調(diào)控代謝性內(nèi)毒素和炎癥因子濃度以及機體的免疫性能等，2019；Kanakaraju等，2015；Papadopoulos等，2009）。現(xiàn)代蕓薹子對泌乳階段母體及其子代生長性能以及腸道菌群結(jié)構(gòu)理論上有正向調(diào)節(jié)作用。為此，本研究采用16S rRNA高通量測序比較分析母鼠泌乳期攝食現(xiàn)代蕓薹子后母鼠及其子鼠盲腸微生物菌群結(jié)構(gòu)差異，并通過檢測母鼠泌乳性能、母鼠及其子代的免疫性能和抗氧化能力，探討現(xiàn)代蕓薹子的藥效機理，為蕓薹子在母畜上的正確應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 本試驗使用動物均為SPF昆明小鼠，由武漢試驗動物研究所提供。分別選購6周齡，40只母鼠和10只公鼠，于實驗室分開散養(yǎng)1周，待適應后按公母比1：3進行合籠，10 d后取出雄鼠，觀察母鼠的懷孕狀況，將確認懷孕的母鼠按照每籠1只進行單籠飼養(yǎng)至分娩。選取產(chǎn)仔時間前后相差不超過1 d、體重（55.00±2.00）g的產(chǎn)后母鼠20只，且調(diào)整至每只母鼠帶仔鼠10只，每窩仔鼠總重差異均不顯著。隨機分為基礎日糧組和試驗日糧組，基礎日糧由試驗動物研究所提供，試驗日糧組為在基礎飼糧中加入5%的菜籽粉，基礎日糧組用同等能量玉米粉代替。飼養(yǎng)至21 d斷奶。

1.2 檢測指標及方法

1.2.1 母鼠每小時泌乳量測定 每天早晨8：00將母鼠取出，用電子天平稱量每窩仔鼠的總重，記為m1，此為隔離前的仔鼠窩重。仔鼠用保溫箱保溫，母鼠正常自由采食和飲水。隔離4 h后，再次稱量每窩仔鼠的總重，記為m2，即仔鼠哺乳前窩重。再將每窩仔鼠放回對應母鼠身邊進行自由哺乳1 h，然后再次將母鼠和對應仔鼠分開，第三次稱量每窩仔鼠的總重，記為m3，即仔鼠哺乳后窩重。再將每窩仔鼠放回對應母鼠身邊自由哺乳，當天的泌乳量稱量結(jié)束。連續(xù)稱量7 d，每天重復第一天的稱量操作過程。

平均日增重=（本周均重-上周均重）/7 d；

母鼠每小時泌乳量=m3-m2+（m1-m2）/4；

式中：m1為隔離前的每窩仔鼠總重，g；m2為仔鼠哺乳前窩重，g，m3為仔鼠哺乳后窩重，g。

1.2.2 體重 記錄試驗子鼠初生窩重、7日齡窩重、14日齡窩重以及21日齡窩重。

1.2.3 血清、組織生理生化指標 試驗結(jié)束后，母鼠、子鼠眼球取血，靜置30 min后分離血清于4℃保存，待測；母鼠采血后剝離皮膚，留取第四對乳腺右側(cè)，用生理鹽水勻漿于4℃保存，待測。

分別采用Elisa試劑盒法檢測催乳素（PRL）和免疫球蛋白（IgG）（試劑盒由泉州睿信生物科技有限公司提供），MDA含量、總蛋白含量、總抗氧化能力、溶菌酶、總氨基酸以及總脂肪含量（試劑盒均有南京建成生物提供）。

1.2.4 腸道微生物 留取母鼠、子鼠盲腸內(nèi)容物，采用16SrRNA對樣品V3+V4可變區(qū)的PCR產(chǎn)物進行測序，由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 18.0進行T檢驗。試驗結(jié)果以“平均值±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓薹子對母鼠泌乳性能的影響 由表1可知，母鼠分娩后1～7 d，攝食蕓薹子泌母鼠的每天泌乳量均有提高（P＞0.05）；第7天小鼠均重、7天內(nèi)日均增重均極顯著高于對照組（P＜0.01），分別提高了14.84%、23.58%；第14天小鼠均重顯著高于對照組（P＜0.05），提高了15.94%；第21天小鼠均重極顯著高于對照組（P＜0.01），提高了17.36%。

表1 蕓薹子對母鼠泌乳性能的影響g

2.2 蕓薹子對母鼠乳腺組織生理生化指標的影響 由表2可知，泌乳鼠攝食蕓薹子后，與對照組相比，母鼠乳腺免疫球蛋白IgG、總蛋白、總氨基酸含量及乳腺中MDA水平無顯著差異（P＞0.05），但有降低乳腺MDA含量的趨勢，乳腺溶菌酶含量提高了54.46%（P＜0.05）。

表2 蕓薹子對母鼠乳腺生理生化指標的影響

2.3 蕓薹子對母鼠及其子鼠血清生理生化指標的影響 由表3可知，泌乳鼠攝食蕓薹子后，與對照組相比，母鼠及其子鼠血清中免疫球蛋白IgG含量顯著下降，分別降低10.86%、12.46%（P＜0.05）。

表3 蕓薹子對母鼠及子鼠血清生理生化指標的影響

2.4 蕓薹子對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 測序數(shù)據(jù)分析 經(jīng)過質(zhì)控過濾、去除嵌合體，將Effective Tags在97%的相似度水平下進行聚類，6個樣品共獲得OUTs 3290個。樣本稀釋曲線，物種累積箱形圖曲線位置趨于平緩（圖1），表明抽樣充分，可以進行數(shù)據(jù)分析。

圖1 樣品多樣性分析

2.4.2 腸道細菌群落結(jié)構(gòu)組成 根據(jù)物種注釋結(jié)果，對四組樣品在各分類水平上進行群落結(jié)構(gòu)分析。在門水平，豐度排前10菌群依次為擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁門（Firmicutes）、變形門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、某細菌（unidentified_Bacteria）、 脫 鐵 桿 菌 門（Deferribacteres）、螺旋體門（Spirochaetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、纖 維 桿 菌 門 （Fibrobacteres）、藍 藻 門（Cyanobacteria）（圖2A）。在屬水平，鑒定出豐度排前10的菌群有擬桿菌屬（Bacteroide）、乳桿菌屬 （Lactobacillus）、瘤胃球 菌 科 某屬（unidentified_Ruminococcaceae）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、棒桿菌科某屬（unidentified_Corynebacteriaceae）、布勞特氏菌屬（Blautia）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、杜氏桿菌（Dubosiella）、肉桿菌屬（Atopostipes）（圖2B）。

圖2 蕓薹子干預后試驗母鼠及子鼠腸道菌群豐度變化

2.4.3 腸道細菌群落多樣性分析

2.4.3.1 Alpha多樣性指數(shù)分析 Alpha多樣性分析主要關注單樣本的多樣性，可以反映微生物群落的豐度和多樣性，常用的度量指標有Ace、Chao1、Shannon和Simpson、Coverage、PD wholetree。Coverage用于計算測序深度，當Coverage＞99%，說明各樣本文庫的覆蓋率較高，能夠代表樣本中菌群落的真實信息。Chao1、ACE用于計算菌群豐度，Shannon、Simpson用于計算菌群多樣性，PD whole-tree用于計算系統(tǒng)發(fā)育多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低；其余指數(shù)值越大，說明相應的群落豐富度、均勻度和多樣性越高。本試驗各樣品Coverage＞99.9%，能夠代表樣本中菌群落的真實信息（表4）。

將試驗組和對照組的Ace、Chao1、Shannon、Simpson、Coverage、PD whole-tree進行T檢驗發(fā)現(xiàn)，攝食云薹子后，母鼠及其子代腸道菌群豐度和多樣性在統(tǒng)計學上沒有顯著差異（表4）。攝食油菜籽的母鼠腸道共鑒定出1683個OTUs，對照組共有1125個OTUs，其中共同的OUTs有1094個；其子代分別有1142個OUTs、1137個OTUs，其中共同的OUTs有962個（圖3）。

表4 蕓薹子對母鼠及其子鼠盲腸菌群Alpha多樣性的影響

圖3 OUT venn圖

2.4.3.2 Beta多樣性分析 攝食云薹子后，與對照組相比，母鼠、子鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)均有差異（R=0.7778和R=0.4074），但不顯著（P=0.1）（表5）。NMDS分析顯示，攝食云薹子后母鼠、子鼠腸道菌群距離均較分散，即不同程度地改變了原有的菌群落結(jié)構(gòu)。GMA聚類分析（binary jaccard算法），母鼠及其子鼠腸道菌群變形門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）豐度明顯增加（圖4）。

表5 組間群落結(jié)構(gòu)差異顯著性檢驗

圖4 蕓薹子茶干預后母鼠及子鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

分類水平總豐度前10的物種豐度聚類熱圖顯示（圖5），母鼠攝食云薹子后，腸道菌群厚壁門（Firmicutes）豐度明顯降低，其中杜氏桿菌屬（Dubosiella）、乳桿菌屬（Lactobacillus）顯著降低，而蘇黎 世 桿 菌 屬 （Turicibacter）、 肉 桿 菌 屬（Atopostipes）、布勞特氏菌屬（Blautia）豐度顯著增加。變形門（Proteobacteria）嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、放線菌門（Actinobacteria）棒桿菌科某屬（unidentified_Corynebacteriaceae）豐度顯著增加，擬桿菌門（Bacteroidetes）擬桿菌屬（Bacteroide）明顯增加。T檢驗分析，攝食云薹子母鼠腸擬桿菌門（Bacteroidetes）擬桿菌屬（Bacteroide）、帕拉普氏菌屬（Paraprevotella）顯著增加（P=0.029，P=0.048），Odoribacter菌顯著減少（P=0.018）（圖6）。LEfSe分析，攝食云薹子母鼠Biomarker菌群為放線菌門（Actinobacteria）、變 形 菌 門 假 單 胞 菌 目（Pseudomonadaies）、莫拉菌科（Moraxellaceae）、擬桿菌門擬桿菌科（Bacteroidaceae）擬桿菌屬（Bacteroides）和厚壁門蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）。進化分支圖顯示，放線菌門、擬桿菌門擬桿菌科、變形菌門假單胞菌目莫拉菌科菌群發(fā)揮主要作用（圖7）。

圖6 T-test母鼠組間屬水平上差異統(tǒng)計

圖7 母鼠LDA值分布柱狀圖和進化分支圖

綜合以上分析，泌乳鼠攝食蕓薹子后，母鼠盲腸放線菌門棒桿菌科某屬（unidentified_Corynebacteriaceae）、擬桿菌門擬桿菌科擬桿菌屬和帕拉普氏菌屬以及變形菌門假單胞菌目莫拉菌科嗜冷桿菌屬變化明顯。而對照組母鼠優(yōu)勢菌群為厚壁門梭狀芽孢桿菌綱梭菌目菌群。

母鼠攝食云薹子后，其子代腸道菌群中擬桿菌門（Bacteroidetes）豐度顯著降低，但擬桿菌屬（Bacteroides）豐度卻顯著增加（圖5）；未鑒定細菌（Unidentified-bacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、螺旋體門（Spirochaetes）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、厚壁門（Firmicutes）豐度明顯增加。厚壁門（Firmicutes）乳桿菌屬（Lactobacillus）明顯降低，蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、瘤胃球菌科某屬（Unidentified-Ruminococcaceae）、布 勞 特 氏 菌屬（Blautia）增加（圖5）。LEfSe分析，子鼠腸道Biomarker菌群為擬桿菌屬酸化菌類（Bacteroidesacidifaciens）和Alistlpes-indistinctus；而對照組子鼠優(yōu)勢菌群為芽孢桿菌綱（bacilli）乳桿菌目lactobacillales乳桿菌科lactobacillaceae和Muribacillaceae乳桿菌屬Lactobacillus（圖8）。

圖5 蕓薹子干預后小鼠腸道菌群在門水平和屬水平上相對豐度熱圖分析

圖8 LDA值分布柱狀圖和進化分支圖

綜合以上分析，泌乳鼠攝食蕓薹子后，子鼠盲腸厚壁菌門豐度增加，但乳桿菌屬下降；擬桿菌門豐度下降，但擬桿菌屬豐度增加。

對每組屬水平豐度前10的菌落進行功能預測，攝食云薹子后，母鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)更傾向于尿素分解代謝、硝酸鹽的代謝以及木聚糖的分解等，即母鼠蛋白質(zhì)代謝和碳水化合物代謝加強，而子鼠更傾向于化學異位作用和發(fā)酵作用（圖9）。

圖9 功能預測

3 討論

3.1 蕓薹子對母鼠泌乳性能的影響 為提高母豬的繁殖性能，在母豬妊娠后期及泌乳期往往補充代謝利用效率高的油脂來減少母豬因生產(chǎn)和泌乳導致的體損失。母豬妊娠后期添加脂肪能提高初乳產(chǎn)量、增加初乳中總脂質(zhì)、乳糖量和IGF-1濃度，從而增加新生仔豬的存活率以及泌乳期仔豬的增重（Laws等，2018；Jin等，2017；Krogh，等2012）。本研究結(jié)果顯示，蕓薹子對母鼠分娩后一周內(nèi)的泌乳量沒有顯著影響，但顯著提高了小鼠7、14、21日齡均重，極顯著提高了分娩1周內(nèi)小鼠的日均增重。因本試驗條件下無法采集乳樣品，雖然試驗組泌乳量無差異，但可能改變了乳成分。

3.2 蕓薹子對母鼠及其子鼠免疫性能、抗氧化性能的影響 乳腺組織由一系列防御機制保護，分為先天性免疫和特異性免疫，在乳汁及乳腺組織中存在有許多可溶性因子如特異性免疫球蛋白、非特異性溶菌酶等殺菌成分發(fā)揮防御作用。本試驗中，泌乳鼠攝食蕓薹子后，母鼠乳腺免疫球蛋白IgG、總蛋白、總氨基酸含量及MDA水平無顯著差異，但卻顯著提高了乳腺溶菌酶含量。

免疫球蛋白IgG是唯一可以通過胎盤的免疫球蛋白，也是主動免疫后機體產(chǎn)生的主要抗體，因此血清中免疫球蛋白IgG含量可以反映機體體液免疫狀況。妊娠期補充膳食脂肪能改善產(chǎn)奶當天初乳質(zhì)量和催乳素濃度，從而影響母豬腸道形態(tài)和先天免疫功能（Xeng等，2019）；從妊娠后期至斷奶補充魚油或者亞麻籽粉均能增加母豬初乳以及泌乳期仔豬血清免疫球蛋白IgG濃度（田美麗等，2016；Wu等，2015；羅杰，2009），但魚油提高了母豬初乳及常乳中炎癥因子濃度和MDA含量，以及母豬、仔豬血漿中MDA含量（申勇，2015），后代易發(fā)生腸道病變并改變免疫細胞穩(wěn)態(tài)（Gibson等，2015）；泌乳母豬日糧中n-6：n-3多不飽和脂肪酸的比例會影響免疫球蛋白和免疫細胞因子的分泌（Yao等，2012），低n-6：n-3比率可改善母豬圍產(chǎn)期代謝變化和炎癥狀況（Papadopoulos等，2009）；但也有研究認為，母豬日糧n-3PUFA對斷奶仔豬的適應性免疫和先天性免疫無明顯影響（Tanghe等，2014）。目前研究均證明，富含油酸的橄欖油、菜籽油或油菜籽、油茶籽均能增強體內(nèi)抗氧化能力和自由基清除酶的活性，降低脂質(zhì)過氧化物含量（申勇，2015；吳琪和楊潔，2011），一定劑量植物油能顯著提高腸道功能酶活性從而促進消化（楊曉燕等，2020），也有油茶籽增強小鼠體液免疫的報道（張東生等，2013），但鮮見有菜籽油或油菜籽增加機體免疫力的相關報道。本試驗中，泌乳鼠攝食含有蕓薹子的飼糧后，母鼠及子鼠血清中IgG含量顯著降低，即對母鼠和子鼠的體液免疫有抑制作用，這可能由于加入蕓薹子后改變了試驗組飼糧脂肪酸組成導致，需要進一步研究證明。

3.3 蕓薹子對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響 動物腸道存在著龐大的微生物群落，由于解剖結(jié)構(gòu)和生理特性的差異，胃腸道各部位菌群在種類、豐度上也明顯不同。盲腸的結(jié)構(gòu)有利于食糜停留，結(jié)腸中食糜的流通速度緩慢，發(fā)酵物質(zhì)多，所以結(jié)腸、盲腸中微生物在數(shù)量和多樣性上都是腸道中最為豐富的。盲腸和結(jié)腸在門水平菌群結(jié)構(gòu)非常相似，有超過90%的細菌歸屬于厚壁菌門和擬桿菌門。腸道微生物不僅影響著食物的消化與吸收，飲食結(jié)構(gòu)也影響腸道微生物結(jié)構(gòu)（譚振，2018）。

小鼠盲腸的優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）。本研究結(jié)果顯示，在門水平泌乳母鼠及子鼠腸道優(yōu)勢菌群依次為擬桿菌門、厚壁菌門、變形門、放線菌門。攝食云薹子后，母鼠厚壁菌門（Firmicutes）豐度下降，擬桿菌門、變形門、放線菌門豐度增加；在屬水平，厚壁菌門杜氏桿菌屬、乳桿菌屬豐度下降，擬桿菌門擬桿菌屬、帕拉普氏菌屬（Paraprevotella）豐度增加。此外，放線菌門棒桿菌科某屬、變形菌門假單胞菌目莫拉菌科嗜冷桿菌屬豐度增加，而對照組母鼠優(yōu)勢菌群為厚壁門梭狀芽孢桿菌綱梭菌目菌群。而與對照組相比，攝食云薹子試驗組子代盲腸菌群中擬桿菌門豐度降低，厚壁菌門豐度增加；屬水平擬桿菌屬豐度增加，乳桿菌屬豐度降低，擬桿菌屬酸化菌類（Bacteroides-acidifaciens）和Alistlpes-indistinctus為腸道菌群的Biomarker。即攝食蕓薹子后，母鼠及其子鼠增強機體免疫力的乳桿菌屬下降，促炎癥類相關的普氏菌屬、擬桿菌屬豐度增加，而這種菌群變化是否導致機體免疫球蛋白IgG含量下降、溶菌酶增加需要進一步研究證明。

4 結(jié)論

泌乳期攝食一定量的現(xiàn)代蕓薹子可改變母鼠和子鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，提高母鼠的泌乳性能，但會抑制母鼠和子鼠的免疫性能。本試驗結(jié)果提示，現(xiàn)代蕓薹子的應用可能需要結(jié)合基礎飼糧脂肪酸組成制定方案。