中短鏈脂肪酸甘油酯和乳酸桿菌對日本沼蝦生長和免疫力的影響

劉 帥， 蔣 麗， 楊 博， 熊貽偉， 傅洪拓*， 劉 波*

（1.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.中國水產科學研究院，北京 100141；3.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006；4.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，江蘇無錫 214081）

水產業高質量發展對養殖環境提出了新要求，飼料端全面禁抗，養殖端減抗、替抗已成產業界及政府監管機構的共識。2019年，農業農村部發布《藥物飼料添加劑退出計劃》，對抗生素的退出提出了具體時間表。從抗生素過度使用到無抗生產，產業界急需要尋求新的促生長、提高抗逆性和品質、無藥殘的環境友好型替代物，中短鏈脂肪酸（林日添等，2017）、復合寡糖類物質（劉含亮等，2012）、大蒜素（宋文華等，2011）等幾大類物質，都有望成為替抗的理想目標。

中短鏈脂肪酸是指由3～12個碳原子組成的脂肪酸類群，其分子質量小，穿透細胞膜能力強。養殖生產中常用的中鏈脂肪酸有己癸酸、月桂酸等，短鏈脂肪酸有甲酸、乙酸等。月桂酸單甘油酯（GML）是中鏈脂肪酸的一種。Li等（2009）發現，GML能夠阻斷猴免疫缺陷病毒SIV的傳播，并且月桂酸單甘油酯在抑制HIV病毒、細胞巨化病毒、皰疹病毒、感冒病毒等方面的應用已經得到了廣泛的驗證（黃藝珠等，2020）。此外，GML還具有增加魚類生長速度（蔣慧琪，2021）、增加蛋雞產蛋量和改善肉質（Zhao等，2019）等功能，不僅在畜牧（Fortuos等，2019）養殖中發揮巨大作用，也對提高水產（Wang等，2021）動物的免疫起到顯著效應。短鏈脂肪酸（SCFAs），即碳鏈6個以下的飽和脂肪酸，易被腸道吸收，可促進腸道發育，具有良好的供能、促免疫能力；丁酸作為應用最廣泛的短鏈脂肪酸，在體內具有供能、抗菌功效（Harrison等，2013），常以添加劑的形式在水產（劉宇等，2020）、畜牧（薛永強等，2020）行業發揮動保功能。

乳酸桿菌能降解腸道中的碳水化合物生成乳酸，降低腸道內pH，抑制不耐酸的有害菌的繁殖，達到防病的功效；同時，其分泌的乳酸可以和鈣離子結合，生成乳酸鈣，促進甲殼類動物的脫殼與生長，因此在水產動物的生長免疫中（Geng等，2011）具有重要調節作用。

日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）俗名青蝦、河蝦，生活史13～14個月，雌雄生長差異很大，多代同堂是日本沼蝦的繁殖特點，其生長速度雄蝦在3 cm后逐漸與雌蝦拉開距離，不同的飼養條件下其生長速度迥異，飼料系數參差不齊，且在進行集約化養殖時其產量往往被高頻爆發的水產病害所限制，因此，在飼料中全面“禁抗”的大環境下如何通過優化日本沼蝦的營養配方達到提高其整體抗逆性能成為當下行業的熱點。已有研究證明，中短鏈脂肪酸聯用時對病毒囊膜和細菌胞膜穿透力更強，具有更廣譜的抗菌作用，且在酸性條件下，大部分病原微生物均會降低活性甚至失活，因而在酸性條件下中短鏈脂肪酸的組合抗病原微生物的能力更強（黃藝珠等，2020）。本研究通過添加乳酸桿菌菌液為中短鏈脂肪酸發揮功效構建酸性環境同時發揮其促免疫作用，探究中短鏈脂肪酸的聯合使用對日本沼蝦生長及免疫的效應，為生產實踐應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼料配比 試驗所用的基礎飼料組成見表1，其中，G0為空白對照組，G1為乳酸桿菌組，G2為0.15%月桂酸單甘油酯組，G3為0.15%丁酸甘油酯組，G4為0.15%月桂酸單甘油酯+0.15%丁酸甘油酯組，G5為0.2%月桂酸單甘油酯+0.2%丁酸甘油酯組。G1～G5組飼料以表1為基礎，在投喂時將活性1.0×1010CFU/mL的乳酸桿菌菌液通過噴涂的方式以1：4（菌液/mL：飼料/g）的比例拌入基礎飼料中形成最終的試驗飼料（結果部分G1～G5組代表已經混入乳酸桿菌菌液的試驗組），G0組以上述方式和比例拌入蒸餾水。

表1 基礎飼料組成及營養水平%

所有原料均經粉碎過40目篩后，按表1的配方比例，加適量水后用攪拌機攪拌均勻，然后擠壓成粒徑為1.2 mm的長條，室溫下風干，再用粉碎機破碎成小顆粒飼料，最后在-10℃冰柜中密封保存備用。月桂酸單甘油酯、丁酸甘油酯、乳酸桿菌等由廣州佰仕路生物科技有限公司生產，其中，飼料制備過程中添加的月桂酸單甘油酯、丁酸甘油酯干粉的純度分別為55%、50%。

1.2 試驗動物與養殖方法 試驗用蝦來源于中國水產科學研究院淡水漁業研究中心宜興大浦基地；蝦苗放入300 L暫養缸中進行2周馴化以備待用，馴化期間使用基礎日糧飼料；馴化結束后停止投喂1 d，將初始體重（0.401±0.007）g的900尾蝦苗（不區分雌雄）按照每個養殖桶50尾，隨機分入18個桶（直徑1.8 m高1 m），每個處理三個養殖桶。試驗期間，保持桶內水深30～40 cm，pH為6.5～7.5，使用氣泵對水體不間斷供氧使溶氧量維持在5 mg/L以上；每次投喂1 h后清理殘餌與糞便，并通過換水（每3 d一次，換水量20%～30%）使氨氮低于0.2 mg/L、亞硝酸鹽含量保持在0.1 mg/kg以下；水溫18～25℃；每日的7：00～8：00、11：00～12：00、16：00～17：00各投喂1次，投餌率大約為體質量的2%～5%，并根據每周平均攝食狀態進行調整，進行為期8周（9月中旬～11月中旬）的養殖試驗。

試驗第1周出現死蝦要及時補充相同數量和體重相當的蝦苗；自第2周起，各試驗桶的死蝦要撈出稱重并記錄，直至試驗結束不再補充蝦的數量。

1.3 樣品收集 試驗結束后，對蝦停止投喂24 h后再進行采樣以減少采樣過程中蝦的應激反應。詳細采樣策略如下：首先收集每個桶中的蝦，分別記錄數量與體重；其次，每組取18尾蝦（每組3個桶，每桶抽取6尾蝦），用含有0.5 mL抗凝劑的一次性注射器從蝦的第3步足基部抽取大約0.5 mL的淋巴血，樣品在4℃冰箱1～2 h后，4℃、3000 r/min離心10 min，收集起上清轉入抗凝管中于-80℃保存，每桶3管血樣，即每組9管血樣，以備相關抗氧化、免疫酶活性的測定；采血后，收集每只蝦的肝胰腺于凍存管轉入液氮保存運輸后轉入-80℃冰箱長期保存，保證每桶6個樣品，以備相關抗氧化酶活性以及基因表達的測定。考慮樣本量以及個體差異等因素（Li等，2014），單個血樣或肝胰腺樣品是由同一試驗桶2或3尾蝦的組織混合而成。

1.4 生長性能分析

增重率/%=（W2-W1）/W1×100；

存活率/%=N1/N0×100；

特定生長率/%=（ln W2-ln W1）/T×100；

餌料系數=W3/（W2-W1）；

式中：W1、W2和W3分別為養殖前后蝦的平均體重及每尾蝦吃食量均重，N0和N1分別為養殖前后試驗桶內日本沼蝦的數量，T為養殖天數。

1.5 抗氧化指標分析 使用南京建成生物工程研究所有限公司的相關試劑盒對蝦的血清及肝胰腺組織總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）酶活性和一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）活性物質含量進行測定評價，以及對抗超氧陰離子（ASAFR）能力進行測試；血清羥自由基清除能力（HRSA）通過蘇州格瑞思生物科技有限公司生產的試劑盒進行測定，其中肝胰腺組織樣品為經過冰生理鹽水清洗，濾紙吸干，稱重，搗碎后移入勻漿器中冰水浴勻漿，并4℃、2500 r/min離心10 min后的上清液。

1.6 熒光定量 使用Trizol法提取蝦中肝胰腺的總RNA，使用NanoDrop 2000 spectrophotometer儀器測定OD值并使樣本定容到500 ng/mL，采用南京諾威贊生物科技股份有限公司的HiscriptIII RT SuperMix for qRT-PCR試劑盒按20μL體系反轉錄為cDNA，每個組別8個重復，設置βactin為管家基因，采用ChamQTMUniversal SYBRqPCR Master Mix試劑盒對日本沼蝦Dorsal蛋白（Dorsal）、熱休克蛋白60（Hsp60）、熱休克蛋白70（Hsp70）、Relish蛋 白 （Relish）、Toll樣 受 體（Toll）和髓樣分化因子Myd88（Myd88）進行熒光定量，定量結果采用2-ΔΔC法（趙姣姣等，2019）進行計算分析；反轉錄所用引物序列采用前人的研究 （Song等，2020；Luo等，2018；Li等，2018；Gu等，2017）成果并由上海捷瑞生物工程有限公司進行化學合成，引物序列見表2。

表2 目標基因與引物序列

1.7 數據分析 試驗數據采用“平均值±標準差”表示，分析軟件為SPSS 20.0，試驗數據先進行方差齊性檢驗；方差齊性后再以組別為變量進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan’s多重比較。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 中短鏈甘油酯對日本沼蝦生長的影響 由表3可知，在末尾均重方面G1和G4組與空白對照G0組相比，均差異顯著（P＜0.05）；增重率方面，G1組和G4組分別較空白對照G0組提升24.99%和26.69%（P＜0.05）；而在存活率中各試驗組與空白對照組之間均不存在顯著性差異（P＞0.05）；在特定生長率中，試驗G1、G4、G5組分別較G0組提升18.92%、18.92%和14.41%（P＜0.05）；在飼料系數中，G5組顯著低于空白對照組28.96%（P＜0.05）。

表3 不同添加劑處理下日本沼蝦的生長性能表現

2.2 中短鏈甘油酯和乳酸對日本沼蝦非特異性免疫性能的影響

2.2.1 血清抗氧化結果 由表4可知，G1組和G3組分別MDA的含量較G0組提升60.71%和47.61%（P＜0.05），G2、G4和G5組與G0組不存在顯著性差異（P＞0.05）；G2、G4、G5組CAT含量分別較G0組提升219.22%、140.94%、431.68%（P＜0.05）；T-SOD測定結果顯示G2、G3、G5組分別較G0組提升50.92%、62.77%、115.36%（P＜0.05）。

表4 不同飼料添加劑處理下蝦血清中與免疫相關的酶活性變化

2.2.2 肝胰腺組織抗氧化酶活 由表5可知，在GSH-PX酶活性方面，G1、G3、G5組分別較對照G0組提升50.37%、56.09%、50.66%（P＜0.05）；ACP酶活性方面，G2和G4組分別較G0組提升28.76%和33.31%（P＜0.05）；NO含量上，G1、G2、G5組分別較G0組提升41.13%、42.74%、43.55%（P＜0.05）；ASAFR上，G1、G2、G3、G4和G5組較G0組分別提升176.61%、73.90%、230.66%、196.07%和136.81（P＜0.05）；AKP活性方面，各組之間不存在顯著性差異（P＞0.05）；HRSA活性方面，試驗G1～G5組分別較G0組提升34.17%、32.65%、31.44%、25.44%和23.32%（P＜0.05）；MDA含量方面，試驗G1～G5組分別較G0組降低39.28%、53.16%、53.98%、37.84%和41.04%（P＜0.05）。

表5 不同飼料添加劑處理下蝦肝胰腺抗氧化酶活的變化

2.2.3 肝胰腺免疫抗氧化熒光定量 熒光定量結果如圖1，在Myd88基因的表達上，G1與G5組分別較G0組提升14.69%和35.17%（P＜0.05）；IMD基因的表達上，僅G2較G0組提升47.49%（P＜0.05）其余各組與G0無顯著性差異（P＞0.05）；HSP70基因 的 表 達 上，G1、G2、G3、G4和G5分別較G0組提升315.10%、293.03%、331.75%、297.35%和379.43%（P＜0.05）；在HSP60基因的表達上，G1和G4組分別較對照組G0降低24.46%和40.45%（P＜0.05），而G3組和G5組則分別較G0組提升44.30%和69.74%（P＜0.05）。在Relish、Dorsal和Toll基因的相對表達量上，各組之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 不同飼料添加劑處理對免疫抗氧化相關基因相對表達量的影響

3 討論

3.1 中短鏈甘油酯和乳酸桿菌對日本青蝦生長的影響 中短鏈脂肪酸甘油酯和乳酸通過改善腸道微生物菌群促進生長，在畜禽上應用已經非常廣泛（徐曉燕等，2012）。本研究發現，丁酸甘油酯、月桂酸單甘酯與乳酸桿菌聯用的G4組可提高日本沼蝦的生長性能。無論是體重、增重率還是特殊生長率，三者聯用都與對照差異顯著，與畜禽上促進生長的影響一致。由此可看出，中短鏈脂肪酸在促進日本沼蝦的生長方面具有良好的效果，在不改變其他環境條件下，能顯著提升其生長速率，在相同的飼喂喂條件下，能顯著提高飼料利用效率。中短鏈脂肪酸甘油酯在傳統的營養需求中，與長鏈脂肪酸不同，是不包含在營養需求中的組分，本研究利用聯合補充中短鏈脂肪酸甘油酯，在改善生長性能方面，獲得了良好的效果，說明中短鏈脂肪酸甘油酯在日本沼蝦的營養需求中，是不可或缺的營養組成，其用量不大，卻能起到重要的生長促進作用。

中短鏈脂肪酸以及其衍生物和乳酸桿菌發揮作用的部位是生物體的腸道，即通過促進脂類代謝和調整腸道穩態的方式（Hu等，2006）加快機體的代謝速率，從而實現機體的快速生長與發育。本研究的后期，水溫降低到20℃以下，單獨加入乳酸桿菌菌液的G1組和三種添加劑聯用的G4組仍然在增重率和特定生長率上表現出與G0組的顯著差異，這說明即使在非最適溫度下養殖日本沼蝦，乳酸桿菌依然可以對日本沼蝦的生長產生顯著促進作用，在一個生長周期內，其促生長的效應顯著；乳酸桿菌對蝦生長免疫方面的促進作用（Wang等，2019）早已被證實，與常規的益生菌發酵飼料（Abu-Elala等，2020）不同，本試驗的乳酸桿菌是在投喂前才與飼料混合，其新鮮度更高，生物活性更好，因而發揮的功效更強。此外，擴散到水體中的乳酸桿菌液呈酸性，因而能夠對水體的pH進行調節，對水環境的穩態有一定的維持作用，這也是促進日本沼蝦快速增重的一個因素，只添加乳酸桿菌的G1組相較于其他各組增重率最高，達到了98.33%。在增重率上，三者聯用添加比例較低的G4組不僅高于添加比例較高的G5組，還高于乳酸桿菌聯用單一中短鏈脂肪酸的G2、G3組，這說明單一中短鏈脂酸可能會對乳酸桿菌發揮功效起一定制約作用，當兩者聯合使用且達到一定閾值時，才能發揮其正向的促進作用。

本研究中飼料系數普遍偏高，這可能是由于在試驗的后期水溫沒有達到日本沼蝦的最適生長溫度，導致試驗蝦攝入體內的飼料大多消耗于維持體溫等日常代謝的穩定，從而降低了飼料的轉化效率，致使飼料系數在計算上偏大。

3.2 中短鏈甘油酯和乳酸桿菌對日本青蝦非特異性免疫的影響 甲殼類動物普遍缺乏獲得性免疫能力，往往只能依賴先天非特異性免疫（袁偉等，2020）；日本沼蝦作為一種典型的甲殼類動物，其主要在血清、肝臟中通過相關酶的分泌獲得非特異性免疫（管曉娟，2009），因而可以用特定酶活性衡量其免疫能力。現行的養殖體系中，為了提高養蝦抗病毒能力，會在養殖過程中，少量使用各類抗生素類物質，但是在實際生產中，日本沼蝦感染白斑綜合征（WSSV）時有發生，在目前全球限抗和替抗的行業需求背景下，尋求營養物質類替抗新品成為產業急需要解決的問題。已經有研究表明，多糖對南美白對蝦的免疫有顯著的功能（季露等，2021）。本研究通過中短鏈脂肪酸的合理配伍，科學地評估了中短鏈脂肪酸對日本沼蝦免疫性能的影響。

MDA、T-SOD、ACP等酶的活性或含量是評估生命體非特異性免疫的重要輔助指標。MDA是機體內自由基與脂質過氧化反應產生的具有細胞毒性的化學物，可以間接反映機體組織的氧化受損程度，被作為評估機體抗氧化能力的一個重要參數；T-SOD作為動物體內經典的抗氧化酶之一，具有維護機體氧化與抗氧化平衡的作用，是動物體內抗氧化的代表酶之一，在免疫指標評估中占據重要的地位；ACP是非底物特異性酶，參與機體鈣磷代謝，與堿性磷酸酶構成經典的非特異性酶。在本研究中，月桂酸單甘油酯、丁酸甘油酯及乳酸桿菌三者聯用的試驗組G4和G5在MDA、T-SOD及ACP上都表現出與空白對照G0組的顯著差異，且MDA與T-SOD的活性提升是單向同步的，證實了三種添加劑具有提升日本沼蝦免疫能力；此外，單一添加月桂酸單甘油酯的G2組與單一添加丁酸甘油酯的G3組的T-SOD活性分別為9.04 U/mL和9.75 U/mL，顯著低于兩者聯用且添加比例相對較高的G5組的12.90 U/mL，但卻顯著高于同樣是兩者聯用但添加比例相對較低的G4組的7.63 U/ml，說明月桂酸單甘油酯及丁酸甘油酯兩者之間可能存在一定的交互作用，且僅當兩者的含量達到一定閾值時才會對免疫力產生顯著的影響，這也是許多研究者呼吁在動物飼料中聯用中短鏈脂肪酸的一個依據（劉宇等，2020）。

當機體長期處于應激狀態時，機體的免疫能力會有所下降（Tahmasebi-Kohyani等，2012），因而可通過測定機體相關的應激蛋白表達量側面評價機體的免疫能力（史晏如，2016）；HSP60、HSP70分別為熱休克蛋白的一種，當機體發生應激反應（如高溫、低溫和饑餓等）時，其表達量會相對增加從而減少由應激導致的機體損傷（Lv等，2021），因而通常將其相對表達量作為衡量生命體非特異性免疫的重要指標之一；在上述結果中，只加入乳酸桿菌的G1組對比G0組，HSP60相對表達量有所下降，此外，在加入乳酸桿菌的基礎上，分別加入月桂酸單甘油酯或丁酸甘油酯都可以促進HSP60的表達，但兩者加入劑量不同時，對機體的表達量的影響也不同，兩者聯用且相對添加比例為1.5%時（G4組）會抑制其表達，而兩者聯用且相對添加比例達到2.0%時（G5組）會促進其表達，這說明兩種中短鏈脂肪酸之間在低濃度時可能存在一定的拮抗作用，而在高濃度時存在一定的互作效應；HSP70基因熒光定量結果顯示，各試驗組相對表達量顯著高于空白對照組，說明乳酸桿菌具有促進HSP70表達的效應。

免疫缺陷同系物（IMD）信號通路（Li等，2013）及Toll信號通路（Xi等，2008）在蝦類先天免疫系統中扮演著重要的角色；IMD信號通路的模式識別受體結合病原體后將促進抗菌肽的表達從而實現對革蘭氏陰性菌入侵的防御；Toll信號通路具有抵抗細菌和病毒感染的能力（De Gregorio等，2002）。Myd88是Toll信號通路中的主要銜接蛋白之一，與細胞內活性氧的產生息息相關（Sharp等，1992）。本研究中Myd88的表達量在G5組達到最高，當前鮮見中短鏈脂肪酸影響IMD、Relish、Toll、Dorsal和Myd88表達的相關研究，但已有研究證實了IMD和Toll信號通路在疾病防御方面具有重要作用（Liu等，2016），與信號通路相關的免疫效應基因轉錄的增加表明了對病原體入侵的免疫反應，說明月桂酸甘油酯和丁酸甘油酯兩者的含量達到一定閾值時能促進免疫力的提升，這也與血清T-SOD酶活性變化的趨勢相一致。

4 結論

本研究結果表明，乳酸桿菌對日本沼蝦的生長具有顯著促進作用，在加入乳酸桿菌的基礎上聯合使用中短鏈脂肪酸不僅能促進生長，還能促進免疫力提升；從試驗設計來看，丁酸甘油酯0.15%、月桂酸單甘酯0.15%和乳酸桿菌25%聯用可顯著提升日本沼蝦血清中CAT酶活、肝胰腺組織ACP酶活及羥自由基清除能力，并降低肝胰腺組織中MDA的含量，同時還可促進熱休克蛋白HSP70的表達，達到顯著提升日本沼蝦免疫能力的效果；從應用角度看，中短鏈脂肪酸可以作為營養成分，起減抗甚至是替抗的作用，在高質量健康養殖中意義重大，其微量但效果顯著，具有良好的應用前景。